In Situ Ca ²⁺ Imaging del sistema nervoso enterico

NOTA: Le procedure seguenti che coinvolgono il tessuto da animali da laboratorio sono coerenti con le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali 2013 e sono state approvate in anticipo dal Michigan State University IACUC. 1. Preparazione del tessuto Anestetizzare animali ricerca in una camera contenente 2,5% isoflurano in ossigeno o mettendo 3-5 ml di isoflurano liquido su un materiale assorbente sul pavimento della camera, in modo che una barriera fisica impedisce animali dal contatto diretto con l'isoflurano. Test per la profondità dell'anestesia pizzicando la zampa. NOTA: La profondità di anestesia è ritenuto appropriato quando non c'è prelievo riflesso dell'arto posteriore. Una volta adeguatamente anestetizzato, eutanasia il mouse dislocazione cervicale Posto l'animale in posizione supina e pulire la pelle addominale con etanolo al 70%. Utilizzare pinze per pizzicare la pelle addominale in linea mediana e usare le forbici chirurgiche per fare un supporto 6 centimetril incisione lungo la linea alba di esporre gli organi digestivi interni. Utilizzare pinze smussato per individuare ed esporre l'ileo all'interno del peritoneo. Tagliare il mesentere ileale / colon con le forbici e iniziare a svelare l'intestino. Una volta che la lunghezza dell'intestino è adeguatamente dipanato, intercettato distale dell'intestino allo stomaco e prossimale al cieco per una preparazione ileo. Per una grande preparazione intestinale, tagliare il distale colon al cieco e prossimale al retto. Rimuovere rapidamente il segmento intestinale e metterlo in un bicchiere con i media DMEM / F12 addizionato con 3 micron nicardipina cloridrato e 1 micron scopolamina cloridrato (di seguito denominato "media") su ghiaccio. L'aggiunta di questi inibitori facilita microdissezione e immagini successive paralizzando la muscolatura liscia dell'intestino. Segmento Taglio di interesse (ad esempio, digiuno, ileo, colon distale o prossimale) sulla base di marcatori anatomici stabiliti. Tipicamente utilize tessuto dal ileo distale o del colon distale. Tuttavia, utilizzare la stessa procedura di base per isolare, di carico e di immagine neuroni e glia mienterici in tutte le regioni intestinali. Rimuovere un piccolo segmento (4-6 cm) di un segmento dell'intestino desiderato e posto in una capsula di Petri Sylgard rivestite pieno di mezzi refrigerati. Fissare l'estremità prossimale e distale del segmento intestinale con perni di insetti e aprire il tubo intestinale facendo una dritta, longitudinale tagliare lungo il confine mesenterica. Tessuto piatto sotto leggera tensione con il lato mucosa e attenzione sezionare via strato mucoso utilizzando una pinza sottile (5 # e # 5/45 di lavoro migliore) e forbici primavera molto fini Pin. NOTA: La rimozione della mucosa può essere molto traumatico per il ENS se non fatto correttamente. Per i preparati di qualità, fare attenzione a limitare brusca eliminazione della mucosa dalla secchezza o raschiamento. La pratica migliore è quello di sollevare la mucosa e tagliare con le forbici sotto pregiati. Tagliare il tessuto in preparazione più piccolos (circa 0,5 cm2) e pin in piatti di imaging (4 angoli con strato muscolare circolare verso l'alto) immessi sul ghiaccio con mezzi freschi. Sezionare con attenzione via muscolo circolare da prendere in giro a parte con le pinzette sottili per esporre il plesso mioenterico. Evitare eccessivo allungamento. Porre piatto di imaging indietro soluzione ghiaccio e il cambiamento con mezzi freschi. Preparare 2 ml di miscela enzimatica per piatto [dispasi 1 U / ml (4.48 mg / 8 ml), Collagenase Tipo II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) nei media]. Rimuovere piatti da ghiaccio e aggiungere il mix enzima dal punto 1.13. Incubare piatti a temperatura ambiente per 15 minuti con 5% di CO 2/95% di aria. Preparazioni di tessuto Lavare con i media 3 volte e angoli re-pin. 2. Loading Fluo-4 Dye NOTA: Evitare photobleaching lavorando con la luce limitata durante la manipolazione di coloranti fluorescenti e tessuto carichi di indicatore coloranti. Preparare 4 mM Fluo-4 soluzione di carico. Aggiungere 1,5 ml media e 1,2 ml di una probenecid magazzino 250 mm ad un'aliquota di 1,5 ml di 4 mm Fluo-4 stock. 4 mM Fluo-4 stock viene preparato aggiungendo 11,4 ml di Pluronic F-127 (20% in DMSO; integrato con 0,25% cremaphor-EL) a 50 mg di Fluo-4, AM. Incubare preparazioni in Fluo-4 soluzione di carico per 45 minuti in un incubatore buio a 37 ° C. Togliere dal incubatore e lavare preparazioni di media 3 volte. Mezzi di scambio per supporti contenente 200 mM probenecid e incubare 15 min a 37 ° C prima di imaging. NOTA: Probenecid è un farmaco che inibisce trasportatori di resistenza ai farmaci in neuroni. L'aggiunta di questo farmaco inibisce la capacità dei neuroni di estrudere coloranti e migliora etichettatura neuronale. Bulk-caricamento di Ca 2+ indicatori coloranti in assenza di probenecid produce principalmente gliali loading cellule. L'aggiunta di probenecid permette la visualizzazione delle risposte neuronali e gliali. Preparare Modified KreBuffer bs. Fare un tampone Krebs modificato tale che le concentrazioni finali (in mM) dei componenti sono come segue: 121 NaCl, KCl 5,9, CaCl 2 2,5, 1,2 MgCl 2, 1.2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO 3, 1 piruvico acidi e 8 glucosio (pH aggiustato a 7,4 con NaOH). Aggiungere 3 micron nicardipina e 1 micron scopolamina per inibire le contrazioni muscolari durante Ca 2+ imaging e tutto il montaggio dissezioni. 3. Imaging e analisi NOTA: utilizzare almeno un impianto di imaging di base con una sorgente di luce fluorescente, microscopio, una camera CCD di qualità e adeguato software di acquisizione. Variare l'aggiunta di altri componenti a seconda della sorgente di luce e l'applicazione specifica. Una ruota del filtro e otturatore devono essere usati con una sorgente di luce allo xeno ad arco tradizionale. Tuttavia, fonti di luce LED e sistemi di illuminazione non richiedono tali componenti. Posizionare il recording camera sotto il microscopio e utilizzando un sistema di perfusione a gravità con più serbatoi siringa riscaldati stabilire un tasso perfusione continua di 2-3 ml / min a 37 ° C tampone Krebs. Assicurati di evitare la formazione di bolle d'aria sia nella linea di ingresso e di aspirazione collegato ad una trappola del vuoto. Portare il plesso desiderati a fuoco in condizioni di illuminazione in campo chiaro. Evitare sovraesposizione del tessuto, che può portare a foto sbiancamento. Esaminare il Fluo-4 di carico all'interno dei gangli e selezionare gangli sano per l'imaging. Malsano gangli / danneggiati esporranno autofluorescenza o puntata morfologia e non devono essere utilizzati per l'imaging. Una volta selezionato ganglio, deviare il percorso della luce per fotocamera e di ottenere immagini dal vivo con il software di acquisizione delle immagini. Assicurarsi che ganglio è a fuoco e impostare l'immagine di tasso di acquisizione e di esposizione volte. NOTA: i tassi di acquisizione delle immagini e tempi variano a seconda degli eventi investigatori vogliono registrare. Per la maggior parte degli esperimenti, le immaginisono tradizionalmente acquisita a 0,5-1 Hz per le cellule gliali e fino a 2-10 Hz per i neuroni, perché gliali Ca 2+ risposte non sono così rapidi come Ca 2+ transitori nei neuroni. Inizia esperimento e stabilire attività di base per 30 sec. Applicare farmaci preriscaldate di interesse come agonisti e antagonisti del recettore utilizzando il sistema di perfusione a gravità ad una velocità di 2-3 ml / min. Seguire applicazione di agonisti / antagonisti ritornando ad una perfusione di tampone normale e consentire un periodo di wash / recupero di almeno 10 min. NOTA: I tempi Drug Application varieranno a seconda del composto individuale e disegno sperimentale. In generale, un'applicazione 20-30 sec di agonista è sufficiente per attivare G-proteine ​​recettori accoppiati in neuroni e cellule gliali. Tuttavia, i canali ionici ligando-dipendenti (come i recettori nicotinici) richiedono tempi di applicazione di non più di 5-10 sec. Ulteriori esposizioni durata causerà canali ionici ligando gated a Dese rapidamentensitize. Antagonisti dovrebbero essere applicate per circa 3-15 minuti per garantire la completa blocco delle vie del recettore. Tuttavia, questa è una generalizzazione lordo e investigatori deve sempre ottimizzare qualsiasi farmaco sperimentale in loro particolare paradigma. Interrompere la registrazione e visualizzazione di film time-lapse dell'esperimento. Selezionare con attenzione regioni di interesse (ROI) utilizzando il software di analisi di immagine appropriata. Utilizzare software per normalizzare e confrontare l'intensità fluorescenza ROI contro il suo valore di base fluorescente iniziale. Le variazioni nella fluorescenza normalizzata sono direttamente proporzionali alle variazioni [Ca 2+]. Utilizzare una modifica di un metodo descritto in precedenza 26 con Af / F = ((F 1 – F 0) / F 0) ROI – ((F 1 – F 0) / F 0) sfondo, dove F1 è la fluorescenza in un dato point e F0 è la fluorescenza basale, per migliorare la precisione di valutazione. Questo aiuti modificanella riduzione del rumore da variazioni di fluorescenza in preparati tissutali che mostrano il movimento dello strato muscolare sottostante plesso mioenterico.