Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

1. Preparazione del materiale, acidi nucleici e proteine Acidi nucleici Autoclave i tubi da 1,5 ml e memorizzarli in un contenitore sterile. Eseguire ogni passo con puntali con filtro sterili per eliminare gli agenti contaminanti cioè nucleasi dal consumo di laboratorio. Preparare Tris-HCl 10 mM a pH 7,5 in acqua DEPC trattati e filtrare la soluzione con un filtro di dimensioni 0,22 micron pori. NOTA: Il oligonucleotide chiamato "TAR" corrisponde alla sequenza RNA breve (29-mer) 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15 mentre CTAR è la sua sequenza complementare DNA 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3'. Solubilizzare sia TAR e CTAR nel buffer Tris di cui sopra (1.1.2.) Per fare 100 micron soluzioni stock. Conservare la soluzione di magazzino CTAR a -20 ° C (aliquote può essere conservato per mesi in queste condizioni). Per la conservazione a lungo termine di RNA, fare 20 aliquote microlitri del TARsoluzione madre, asciugare ciascuna aliquota mediante un concentratore centrifuga a vuoto e conservare a -80 ° C. Appena prima dell'uso, risospendere ciascuna aliquota TAR in 20 acqua DEPC trattati microlitri. NOTA: aliquote TAR di lavoro può essere conservato a -20 ° C per due settimane. Proteine ​​e NC (12-55) NC peptide Preparare il full-length proteina ricombinante NC come riportato. 16 Conservare la soluzione di riserva in aliquote a -20 ° C. Determinare la concentrazione di proteine ​​esatta con uno spettrofotometro UV-Vis con un coefficiente di estinzione a 280 nm di 6.410 M -1 cm -1. Risospendere il sintetico (12-55) NC peptide in Tris-HCl 10 mM pH 7.5 e conservare la soluzione di riserva in aliquote a -20 ° C. Determinare la concentrazione di peptide corretta su uno spettrofotometro UV-Vis utilizzando un coefficiente di estinzione a 280 nm di 5.700 M -1 cm -1. NOTA: La (12-55) NC peptide è stato ottenuto HPLC purificato e lyophilized su una soluzione contenente due equivalenti di cloruro di zinco. Composto 1 Pesare circa 1 mg del composto liofilizzato 1 utilizzando una bilancia analitica e sciogliere in 100 ml di 100% DMSO, opportunamente pesati, per ottenere una concentrazione elevata (≈10 mM) soluzione madre. Determinare la concentrazione del composto esatto su un UV-Vis spettrofotometro con il suo coefficiente di estinzione (a 354 nm: 11.387 M -1 cm -1). Conservare la soluzione madre al buio a -20 ° C prima dell'uso. 2. Creazione di Gel Apparecchi e Casting del Gel Per impostare il gel, lavare due piatti (uno lungo e uno corto) con il 70% di etanolo, lasciarli asciugare e quindi inserire due distanziali 1 mm lungo i bordi lunghi della piastra lungo; coprirlo con breve piatto, e assicuri allineare le due piastre a fondo. Per lanciare il gel, seguire le istruzioni fornite dal suppLier (diversi fornitori, usare un apparato leggermente diverso; pinze a sandwich e pile sono forniti da ciascun apparato casting). In tutti i casi, essere sicuri che morsetti, faraglioni e le guarnizioni sono pulite, e rimuovere le tracce di acrilamide lasciati dagli utenti precedenti. Posizionare il sandwich di gel assemblato nello stand casting e seguire le istruzioni specifiche da parte del fornitore. NOTA: Solitamente una guarnizione siliconica pulita nella parte inferiore della scanalatura colata garantisce una buona tenuta e aiuta a evitare perdite quando si versa il gel. Per controllare le perdite, versare acqua distillata con una pipetta tra le lastre di vetro. Aggiungere acqua per riempire il panino e attendere qualche minuto per assicurarsi che non ci siano perdite. Se il sandwich è montato correttamente, rimuovere l'acqua e inserire una carta da filtro tra i due bicchieri per asciugare i bicchieri. Rimuovere la carta e ora il panino è pronto per il gel casting. Versare il gel a temperatura ambiente (RT, 25 ° C). Poiché poliacrilammide è altamente neurotossico, indossare guanti. Noie continui 12% gel di poliacrilammide in non-denaturazione condizioni (nativi) per eseguire test NAME. Preparare la soluzione di gel al 12%: mescolare 12 ml di 40% acrilammide / bisacrilammide soluzione (19/1), 4 ml TBE 10x tampone (10x: Tris-HCl 890 mm, 890 mm borato, EDTA 20 mm) ed acqua 24 ml MilliQ . Aggiungere 400 microlitri APS e 50 ml TEMED immediatamente prima dell'uso. Mescolare la soluzione e rapidamente utilizzare una pipetta per versare la soluzione giù tra le lastre di vetro. Introdurre il pettine tra le lastre di vetro, evitando bolle. Aggiungere la soluzione di gel per riempire completamente il panino. Lasciate che il gel polimerizzare per 45 minuti a 1 ora. Immediatamente prima del caricamento del campione, rimuovere il pettine lentamente e sciacquare i pozzetti a fondo con acqua distillata. Dopo le fasi di polimerizzazione e pozzi risciacquo, seguire le istruzioni specifiche da parte del fornitore per posizionare il sandwich di gel nell'apparato per elettroforesi su gel verticale. Se un sistema di raffreddamento è presente, assicurarsi di collocare il sistema gel nel correct posizione del nucleo raffreddamento. Se il sistema è progettato per gestire più di un gel, ma solo un gel deve essere eseguito, collegare un sandwich di gel come buffer di sbarramento al nucleo raffreddamento sul lato opposto per formare la camera di completa tampone superiore. NOTA: se la diga non è posizionato correttamente, il buffer superiore perderà probabilmente fermare la corsa del gel. Preparare 2,5 L di TBE tampone di corsa (1x: Tris-HCl 89 mM, borato 89 mm, EDTA 2 mM) in acqua deionizzata. Distinguono circa 500 ml di tampone TBE per la camera tampone superiore e versare il resto nella camera polmone inferiore. Versare il restante tampone TBE 500 ml nella camera tampone superiore. Posizionare il coperchio sulla parte superiore della camera polmone inferiore, in modo che l'anodo e il catodo sono nella posizione appropriata. Collegare il nucleo di raffreddamento, se presente, ad un rubinetto dell'acqua utilizzando tubi. Riempire il nucleo con acqua di rubinetto, che fungerà da dissipatore di calore durante l'elettroforesi, e lasciare che l'acqua del rubinetto circolare attraverso il nucleo durante elettirophoresis. 3. nucleocapside Ricottura-mediata elettroforesi (NAME) Assay Preparazione del buffer Preparare tampone TNMG (1x: Tris-HCl 10 mM, NaCl 20 mM, Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7,5) acqua in DEPC trattati e filtrare la soluzione con un filtro di dimensioni 0,22 micron pori. NOTA: Tampone TNMG può essere conservato a 4 ° C fino a 7 giorni. Per ottenere i migliori pieghevoli e ricottura risultati, si consiglia l'uso di buffer appena fatte. Preparare il tampone contenente SDS gel Loading (GLB SDS: Tris-HCl 100 mM, EDTA 4 mM, 50% w / v glicerolo, 2% w / v SDS, 0,05% w / v blu di bromofenolo) in acqua trattata con DEPC. NOTA: GLB aiuta a tenere traccia di quanto i campioni oligonucleotidi sono in esecuzione nel sistema gel e permette di affondare i campioni nel gel. L'aggiunta di SDS al GLB è una fase critica per il successo ottimale di dosaggio NAME. Se questo passaggio non è seguita, non è possibile distinguere banda acidi nucleici nella gel Sistema (Figura 2). Controlla la preparazione Diluire serialmente gli oligonucleotidi soluzioni madre e utilizzando appena fatte 10 mM soluzioni per preparare 10 ml di una soluzione 1 mM di TAR. Preparare nello stesso modo, separatamente, 10 ml di una 1 mM in tampone CTAR TNMG 1x. Riscaldare ogni tubo a 95 ° C per 5 minuti e poi lasciare raffreddare a RT perché TAR e CTAR ad assumere le loro strutture stem-rigonfiamento-loop. Preparare 1 micron soluzione TAR ibrida / CTAR come controllo. Mescolare 1 ml di 10 mM TAR con 1 ml di 10 mM CTAR in TNMG 1x, in un volume totale di 10 microlitri. Denaturare gli oligonucleotidi riscaldando il tubo a 95 ° C per 5 minuti e lasciare raffreddare lentamente a RT affinché TAR per ricottura alla sua sequenza complementare CTAR e per formare il doppio filamento ibrido TAR / CTAR. Quando le soluzioni sono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione breve-spin. Aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta eacsoluzione h all'interno del tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Mantenere i campioni di controllo costante sul ghiaccio fino alla fase di carico. I campioni di preparazione per l'analisi delle proteine ​​e NC (12-55) NC attività peptide Utilizzare 2,5 ml di soluzione appena fatto oligonucleotide 4 micron per ogni campione. Preparare sempre una piccola quantità in eccesso di ogni soluzione per evitare errori di pipettamento. Piegatura 32,5 ml di 4 mM soluzione TAR e, separatamente, di CTAR in TNMG 1x tampone come riportato per la preparazione controlli suddetto (passo 3.2.1.). Diluire la soluzione madre sia di proteine ​​e NC (12-55) NC peptide a 80 micron soluzione con acqua MilliQ. Quando le soluzioni TAR e CTAR vengono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione a breve giro di entrambi i tubi e avviare la preparazione dei tubi campioni. Preparare 12 vuoti da 0,5 ml tubi in autoclave. Mettere 3 file di 4 tubi nel rack per campioni di laboratorio. Ogni riga indica rispettivamente i campioni da analizzare the full-length proteina NC, i campioni senza proteine ​​e campioni per analizzare il (12-55) NC attività di peptide. Sostituire sempre consigli ogni volta viene utilizzato un reagente diverso. Aggiungere in ciascun tubo di 2,5 ml di TAR piegato e 2,5 ml di piegato CTAR. Aggiungere acqua trattata con DEPC 4 microlitri ai campioni per l'analisi di NC e (12-55) NC. Aggiungere acqua DEPC trattati con 5 microlitri agli altri campioni. Aggiungere 1 ml di 80 micron NC o 1 ml di 80 micron (12-55) NC per i campioni per, rispettivamente, NC o (12-55) Analisi NC. Aggiungere immediatamente 3 ml di GLB SDS al tempo 0 min campioni (segnalato come 0 'nella figura 1), la soluzione pipettando all'interno di ogni tubo 3 volte, e infine mettere la provetta in ghiaccio. Ripetere questo passaggio per tutti i campioni ed i controlli. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico. Dopo 15 min, 30 min e 1 ora di incubazione a RT, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta la soluzione all'interno each tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Ripetere questo passaggio per tutti i campioni ed i controlli, rispettivamente, e tenere in ghiaccio fino alla fase di carico. Rimuovere il coperchio dell'apparecchiatura gel. Carico 13 microlitri di ciascun campione nei pozzetti formata come precedentemente descritto per fusione del gel con un pettine ben formatura. Caricare i campioni secondo l'ordine riportato in Figura 1. Sostituire il coperchio dell'apparecchiatura gel. Attaccare i cavi dell'apparato gel all'alimentatore. Verificare che gli elettrodi sono collegati nelle fessure corrette di alimentazione. Accendere ed eseguire il gel per 2 ore e 30 minuti ad una tensione costante di 200 V, fino a quando il colorante è migrato a 1,5 cm sopra il fondo del gel. La preparazione del campione per analizzare l'attività antrachinone su NC e (12-55) NC Diluire la soluzione stock compound 1. Preparare 10 ml di 500 micron, 250 micron, 50 micron, la diluizione 5 micron di composto <strong> 1 in acqua MilliQ. Preparare i campioni di controllo, come riportato in precedenza (punto 3.2.). Utilizzare 2,5 ml di soluzione appena fatto oligonucleotide 4 micron per ogni campione. Preparare sempre una piccola quantità in eccesso di ogni soluzione per evitare errori di pipettamento. Piegare 27,5 ml di 4 micron soluzione di TAR e, separatamente, di CTAR in tampone TNMG 1x come sopra menzionato (punto 3.2.1.). Diluire la soluzione madre sia di proteine ​​e NC (12-55) NC peptide di 80 micron soluzione in acqua. Quando le soluzioni TAR e CTAR vengono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione a breve giro di entrambi i tubi e avviare la preparazione dei campioni. Preparare 20 vuoti da 0,5 ml tubi in autoclave. Mettere 2 file di 10 tubi ciascuno nel rack per campioni di laboratorio. Sostituire sempre consigli ogni volta viene utilizzato un reagente diverso. Aggiungere ogni tubo della prima fila con 2,5 ml di TAR piegato. Aggiungere ogni tubo della seconda fila con 2,5 ml di piegato CTAR. <li> Aggiungere 2 ml di composto appropriata 1 di diluizione (concentrazioni crescenti dai 5 micron a diluizione 500 micron) al TAR e al CTAR. Sostituire composto con acqua nei campioni per l'analisi di NC e (12-55) NC in assenza del composto. Incubare i campioni per 15 minuti a RT. Dopo 15 min di incubazione, miscelare i campioni CTAR (tubi di seconda fila) con i campioni corrispondenti TAR (tubi di prima fila). Aggiungere 1 ml di 80 micron NC o 1 ml di 80 micron (12-55) NC ai campioni di NC o (12-55) analisi NC, rispettivamente. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta ogni tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Ripetere questo passaggio, rispettivamente, con i campioni di NC e (12-55) Analisi NC. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico. Rimuovere il coperchio dell'apparecchiatura gel. Caricare 13 ml di ciascun campione nei pozzetti. Caricare i campioni con la sequenza indicata in FigUre 3B. Sostituire il coperchio dell'apparecchiatura gel. Attaccare i cavi dell'apparato gel all'alimentatore. Verificare che gli elettrodi sono collegati nelle fessure corrette di alimentazione. Accendere ed eseguire il gel per 2 ore e 30 minuti ad una tensione costante di 200 V, fino a quando il colorante è migrato a 1,5 cm sopra il fondo del gel. Preparazione del campione: la modalità Oligo-preincubazione vs modalità NC-preincubazione Diluire il composto 1 soluzione madre. Preparare 10 ml di 500 micron, 250 micron, 50 micron, 5 micron di diluizione del composto 1 in acqua MilliQ. Preparare i campioni di controllo, come riportato in precedenza (punto 3.2.). Utilizzare 2,5 ml di soluzione di oligonucleotide 4 mM per ogni campione. Preparare sempre una piccola quantità in eccesso di ogni soluzione per evitare errori di pipettamento. Piegare 27,5 ml di 4 micron soluzione di TAR e, separatamente, di CTAR in tampone TNMG 1x come sopra accennato (punto 3.2.1.). Diluire la soluzione madre sia di proteine ​​e NC (12-55) NC peptide di 80 micron soluzione in acqua. Quando le soluzioni TAR e CTAR vengono raffreddati a RT, eseguire una centrifugazione a breve giro di entrambi i tubi e avviare la preparazione dei campioni. Sostituire sempre consigli ogni volta che i reagenti vengono modificate o se qualsiasi altro liquido o soluzione contenuta nella provetta di reazione viene toccato. Da questo passo assicurarsi di etichettare in modo chiaro e separare i campioni per le due diverse procedure di pre-incubazione. Modalità Oligo-preincubazione Preparare 10 vuoti da 0,5 ml tubi in autoclave. Mettere 2 file di 5 tubi nel rack per campioni di laboratorio. Aggiungere in ciascun tubo della prima fila 2.5 ml di TAR piegato. Aggiungere in ciascun tubo della seconda fila 2.5 ml di piegato CTAR. Aggiungere 2 ml di composto appropriata 1 di diluizione (concentrazioni crescenti dai 5 micron a diluizione 500 micron) al TAR e al CTAR.Sostituire composto con acqua nei campioni per l'analisi di NC in assenza del composto. Incubare i campioni per 15 minuti a RT. Dopo 15 min di incubazione, prendere i campioni CTAR (seconda fila) e metterli con i campioni corrispondenti TAR (prima fila). Aggiungere 1 ml di 80 mM NC a ciascun campione e incubare i campioni per 15 minuti a RT. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta ogni tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico. NC-preincubazione mode Preparare 5 vuote 0,5 ml tubi autoclave e metterli nel rack per campioni di laboratorio. Aggiungere in ciascun tubo 4 microlitri del composto 1 di diluizione appropriata (crescente concentrazione dal 5 mM alla diluizione 500 mM). Sostituire composto con acqua nei campioni per l'analisi di NC in assenza del composto. Aggiungere in ogni provetta 1 ml di 80 μ; M NC e incubare i campioni per 15 minuti a temperatura ambiente. Mescolare 15 ml di TAR piegato con 15 ml di piegato CTAR in un tubo e utilizzare questa soluzione TAR + CTAR nella fase successiva. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere a ciascun campione 5 ml della soluzione di miscela TAR + CTAR e incubare i campioni per 15 minuti a RT. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 3 ml di GLB SDS, pipetta ogni tubo 3 volte e mettere il tubo in ghiaccio. Mantenere i campioni costante sul ghiaccio fino alla fase di carico. NOTA: Dal punto 3.5.8 in poi, l'analisi può essere eseguita con tutti i campioni (curriculum da 3.5.7). Rimuovere il coperchio dell'apparecchiatura gel. Caricare 13 ml di ciascun campione nei pozzetti. Caricare i campioni secondo l'ordine riportato in Figura 4. Sostituire il coperchio dell'apparecchiatura gel. Attaccare i cavi dell'apparato gel all'alimentatore. Verificare che gli elettrodi sono collegati nelle fessure corrette della suppl poterey. Accendere ed eseguire il gel per 2 ore e 30 minuti ad una tensione costante di 200 V, fino a quando il colorante è migrato a 1,5 cm sopra il fondo del gel. 4. Rimozione Gel e Gel colorazione Dopo l'elettroforesi, spegnere l'alimentazione e scollegare i cavi elettrici. Chiudere il rubinetto dell'acqua del sistema di raffreddamento e scollegare i tubi dal nucleo. Rimuovere il coperchio, e, se il sistema è stato raffreddato, rimuovere il nucleo di raffreddamento e versare il tampone da entrambe le camere. Disassemblare delicatamente il gel sandwich dall'apparecchio e rimuovere tutti i morsetti dalle lastre di vetro. Per rimuovere il gel dalle piastre, premere uno dei distanziatori fuori al lato delle piastre e ruotarlo delicatamente per tirare e rimuove la lastra di vetro superiore. Afferrare due angoli del gel e sollevarlo delicatamente per rimuoverlo dal vetro. Porre il gel in un contenitore adatto con la soluzione colorante per acidi nucleici desiderata30-45 min sotto agitazione. Dopo la colorazione, mettere il gel su un transilluminatore sistema di imaging per rilevare acidi nucleici segnale di fluorescenza nel sistema gel.