This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.
ARN ou ADN plié en pliage tridimensionnel stable sont des cibles intéressantes dans le développement de médicaments antiviraux ou anti-tumorale. Dans le cas du VIH-1, les protéines virales impliquées dans la régulation de l'activité du virus reconnaissent plusieurs acides nucléiques. La protéine de nucléocapside NCp7 (NC) est une protéine de régulation clé plusieurs procédés au cours de la réplication du virus. NC est en fait un chaperon déstabilisant les structures secondaires de l'ARN et de l'ADN et facilitant leur recuit. L'inactivation du NC est une nouvelle approche et une cible intéressante pour la thérapie anti-VIH. Le N ucleocapsid Un nnealing- M ediated E lectrophoresis (NOM) test a été développé pour identifier des molécules capables d'inhiber la fusion et le recuit de l'ARN et de l'ADN plié en conformations tridimensionnelles thermodynamiquement stables, comme les structures en épingle à cheveux de goudron et éléments cTAR du VIH, par la protéine de nucléocapside du VIH-1. Le nouveau test emploie soit la rérecombinant ou la synthèse des protéines, des oligonucléotides et sans la nécessité de leur marquage précédente. L'analyse des résultats est réalisée par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide standard (PAGE) suivie d'une coloration d'acide nucléique conventionnel. Le protocole rapporté dans cet ouvrage explique comment effectuer le NOM test avec la protéine pleine longueur ou sa version tronquée dépourvue du domaine N-terminal de base, à la fois compétente comme les acides nucléiques chaperons, et comment évaluer l'inhibition de l'activité de chaperon NC par un filetage intercalant. En outre, le nom peut être effectué dans deux modes différents, utile pour obtenir des indications sur le mécanisme d'action présumé des inhibiteurs NC identifiés.
La protéine de nucléocapside NCp7 (NC) de l'immunodéficience humaine virus de type 1 (VIH-1) est une petite protéine basique qui est étroitement associé à l'ARN génomique du virus infectieux mature, jouant un rôle essentiel dans la réplication du virus en tant que cofacteur pendant la transcription inverse , la reconnaissance du génome, et l'emballage. 1-3 NC agit comme un chaperon d'acide nucléique catalyser la déstabilisation des structures stables d'acide nucléique et l'hybridation de séquences complémentaires. Son activité acide nucléique agrégation réside principalement dans les 11 acides aminés N-terminal alors que l'activité déstabiliser duplex a été cartographiée à ses structures de doigt de zinc (12 à 55 peptidiques). 4 La protéine chargée positivement abaisse la barrière électrostatique de la réaction d'hybridation et augmente la vitesse à laquelle les deux séquences complémentaires distincts se rejoignent.
Les acides nucléiques pliées de conformation stable exigent les activités chaperonnes de NC à facilitate leur recuit 5 Cela est particulièrement important dans la transcription inverse, où NC est critique dans des événements de transfert de brins:. dans le transfert brin moins, l'ADN d'arrêt brin moins, tout rétrotranscrit, doit être transférée et hybridée à une séquence complémentaire de la région R à l'extrémité 3 'du génome de l'ARN matrice. 6 Bien que thermodynamiquement favorisée, cette réaction ne se produit pas largement en l'absence de NC en raison de la présence de la structure stable de l'activation trans région sensible (TAR) ARN dans les régions de recherche, qui doit être associé à sa copie d'ADN (cTAR ADN). Les sept régions cTAR et TAR sont, en fait, très structuré avec une tige-boucle conformation caractéristique. NC protéine se dénature ces épingles à cheveux, et favorise le transfert de brin négatif en augmentant le taux de recuit intermoléculaire entre les brins d'acide nucléique complémentaires. Le mécanisme de NC recuit de goudron et cTAR a été soigneusement étudié et dedécrite comme test TAR de recuit dans plusieurs documents de recherche et le schéma proposé est représenté dans d'excellentes critiques. 8-11 Résumer, NC déstabilise la structure secondaire de l'ARN stable comme TAR-ARN, déstabilise la structure secondaire de sa séquence complémentaire, cTAR-DNA et favorise la réaction d'annelage de l'ARN / ADN conduisant à TAR / cTAR formation d'hétéroduplex. 10,11 Par conséquent, l'étape de transfert de brin pendant la replication du VIH est favorisée. 12
NC est une cible intéressante pour le développement de nouveaux agents antiviraux puisque les risques d'interférence induite par de petites molécules en vue NC entraînerait une diminution de la transcription inverse du génome viral à la suite d'une activité NC compromise. 2,13 Cette approche pourrait finalement conduire au développement d'agents anti-VIH réussies. Dans le cadre d'un dépistage de la NC inhibiteurs 14 nous avons développé un test en se appuyant sur les propriétés bien connuesde nucléocapside de déstabiliser efficacement et recuit oligonucléotides complémentaires 10,11. Nous l'avons appelé N ucleocapsid Un nnealing- M ediated E lectrophoresis (NOM) dosage. NOM essai utilise NC pour arbitrer le recuit entre les copies de manière stable structurés d'acides nucléiques complémentaires, dans notre cas de l'oligonucléotide correspondant à la partie apicale d'une séquence TAR-ARN avec sa séquence d'ADN complémentaire (cTAR) pour donner le hybride TAR / cTAR heteroduplex . L'analyse de la TAR / cTAR réaction de recuit en présence de NC peut être étudiée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (PAGE).
Ce protocole montre comment effectuer le dosage NOM à recuire rapidement à des oligonucleotides à la température ambiante dans des structures pliées en épingle à cheveux stable, la manière d'analyser les résultats de la réaction et éventuellement de dépannage de l'expérience. Le marquage radioactif de l'acide nucléique ne est pas demandée, et detectisur des bandes d'oligonucléotides peut être réalisée par des procédés classiques de coloration. L'essai, qui emploie soit la protéine pleine longueur recombinant ou une version synthétique tronqué de NC, permet l'identification des agents intercalants d'enfilage NC inhibant une activité corrélée à une forte liaison à l'ARN et de l'ADN 14.
NAME est un test qui permet d'évaluer rapidement l'inhibition de l'activité de chaperon de la protéine de nucléocapside du VIH-1, une cible intéressante pour la recherche de nouveaux médicaments anti-VIH. NC annèle rapide et à des acides nucléiques de température ambiante dont pliage stable exigerait autrement dénaturation thermique à haute température suivi d'un recuit prudent. Le dosage peut être effectué soit avec pleine longueur NC ou avec le tronquée (12-55) NC: dans les deux cas, les deux acides nucléiques (ARN et sa copie d'ADN complémentaire) sont recuits rapidement. Ceci est cohérent avec l'observation de la littérature avec le tronc NC peptide: recuit est initiée par la fusion efficace de la tige de cTAR suivie par interaction de la boucle apicale complémentaire, qui est un faible site de liaison de NF, avec la séquence complémentaire de TAR boucle apicale, de se retrouver à travers plusieurs intermédiaires instables à l'hybride recuit étendu. 21
NC est une prot très stableein et quelques problèmes lors de NOM performant peuvent se produire. Il est très important cependant pour ajouter SDS fraîchement préparés dans le Gel Loading Buffer utilisé pour arrêter la réaction: si cela ne est pas atteint, le gel ne sera pas montrer les bandes d'acides nucléiques dans les positions correctes. En fait, NC est une protéine de liaison d'acide nucléique, de sorte que de visualiser correctement TAR / cTAR heteroduplex par électrophorèse sur gel de SDS doit être présent dans le tampon de chargement de gel pour dénaturer la protéine et le libérer de son complexe étanche avec les acides nucléiques. Ce est aussi un possible dépannage de l'expérience, ce est à dire la formation de bandes décalées pendant la course au gel. Cet effet est particulièrement évident lorsque la pleine longueur NC a été utilisé, comme dans la figure 2, et est liée à la présence de la queue N-terminale fortement basique, ayant un effet d'agrégation solide sur les acides nucléiques.
La présence de la queue de base terminal effectue la réaction de recuit plus difficile d'être inhibé, comme le montrentn à la figure 3 en utilisant le composé 1, un filetage intercalant représentant, soit une intercalant particulièrement efficace à stabiliser les structures tige-boucle de goudron et de cTAR. En fait, ce type d'interaction avec des acides nucléiques est favorisée lorsque des renflements et des boucles interrompent la continuité de la double hélice, ce qui permet un enfilage plus facile de les substituants volumineux dans les paires de bases. Stabilisation de TAR et cTAR par ces liants d'acides nucléiques a été préalablement analysé par la détermination de l'augmentation de la température de fusion des deux oligonucleotides. 14 En outre, l'augmentation de la température de fusion est en corrélation avec l'inhibition de l'hybridation catalysée par le VIH-1 NC, conduisant à la formation réduite de la TAR hétéroduplex / cTAR et indiquant que intercalants filetage constituent une classe intéressante de liants pour des structures dynamiques de l'ARN tel que l'élément TAR. 14
Le mécanisme d'action invoquée pour ces compounds peut encore être validé en effectuant le test in NOM différents formats de rechange, comme représenté sur la figure 4: dans le cas des agents intercalants de l'inhibition de recuit heteroduplex est améliorée lorsque le médicament est incubé avec les deux oligos pliées. Composés agissant avec mécanisme d'action différent, comme liants directs de la protéine NC, seraient moins touchés par les différents mode de pré-incubation. NOM test effectué dans les deux méthodes peuvent donc être utilisés pour cribler des bibliothèques de composés pour l'identification d'inhibiteurs NC, et aussi pour évaluer le mécanisme d'action présumé des réponses positives lors de la recherche pour les médicaments anti-VIH ciblées au NC. De toute évidence, l'utilisation de ces seules techniques lors réclamé un mécanisme spécifique d'action des inhibiteurs identifiés NC ne est pas suffisant, et d'autres tests biochimiques appropriés sont nécessaires pour soutenir l'hypothèse de travail. 14
Enfin, il faut souligner que NOM utilise trèsenzymes purifiées, soit recombinaison ou de synthèse, ce qui donne des informations précieuses sur l'inhibition "in vitro" de NC par les composés testés. Ce est la "force et la faiblesse" de l'essai: NOM peut ainsi compléter criblage virtuel et modélisation moléculaire approches dans les étapes préliminaires de programmes de découverte de médicaments, permettant de construire et d'analyser rapidement les relations structure-activité et éventuellement réorienter la conception de synthèse et de drogues. Cependant, comme d'autres dosages biochimiques utilisés dans des projets de développement de médicaments dans le VIH, NOM ne donnera pas d'informations sur les effets des inhibiteurs putatifs dans les cellules infectées par le virus.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock solution at -20 °C | |
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock aliquot at -80 °C | |
(12-55)NC peptide | EspiKem srl | Store the stock solution at -20 °C | |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | Autoclave before use |
0.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 121 023 | Autoclave before use |
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µL | Sarstedt | 701,130,210 | |
Biosphere Filter Tips 2-20 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
Biosphere Filter Tips 200 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
Syringe Filter 0,22 µm | Biosigma srl | 51,798 | |
Ethanol | Carlo Erba | 414631 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | 71725-50G | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-1L | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71376-1KG | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252-2.5KG | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
Magnesium Perchlorate | Sigma-Aldrich | 222283-100G | Store the 1M solution at -20°C |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49770-1L | |
Bromophenol Blue | GE Healthcare Life Sciences | 17-1329-01 | |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-100ML | |
Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A7460-500G | Prepare the 10% solution freshly before use |
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) | Merck Millipore | 1006401000 | Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting |
Tris ultrapure | Applichem | A1086,1000 | |
DEPC-treated water | Ambion | AM9922 | |
Centrifuge 5415R | Eppendorf | 22,621,408 | |
NanoDrop 1000 spectrometer | Thermo Scientific | ||
UV-VIS spectrometer Lambda 20 | Perkin Elmer | ||
Protean II xi Cell | Bio-Rad | 165-1803 | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
SybrGreen II RNA Gel Staining | Lonza | 50523 | Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4°C for two weeks |
Geliance 600 Imaging System | Perkin Elmer |