قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات
概要
This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.
Abstract
RNA أو DNA مطوية في للطي ثلاثي الأبعاد مستقر أهدافا مثيرة للاهتمام في تطوير انتيتومور أو الأدوية المضادة للفيروسات. في حالة HIV-1، والبروتينات الفيروسية المشاركة في تنظيم نشاط الفيروس تعترف عدة الأحماض النووية. البروتين قفيصة منواة NCp7 (NC) هو بروتين أساسي ينظم عدة عمليات خلال تكاثر الفيروس. NC هو في الواقع كوصي زعزعة استقرار الهياكل الثانوية من الحمض النووي الريبي والحمض النووي وتسهيل الصلب الخاصة بهم. وتثبيط NC هو نهج جديد وهدفا للاهتمام للعلاج لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. ucleocapsid على N A nnealing- M ediated E lectrophoresis تم تطوير (NAME) فحص لتحديد الجزيئات قادرة على منع ذوبان والصلب من الحمض النووي الريبي DNA ومطوية في التشكل ثلاثي الأبعاد مستقرة الديناميكا الحرارية، مثل الهياكل دبوس الشعر من القطران وعناصر cTAR من فيروس نقص المناعة البشرية، من خلال البروتين قفيصة منواة من HIV-1. فحص جديد يستخدم إما إعادةcombinant أو البروتين المركب، و[أليغنوكليوتيد دون الحاجة لوضع العلامات السابقة. ويتحقق تحليل النتائج وفقا لمعيار الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (PAGE) تليها التقليدي تلطيخ الحمض النووي. يصف بروتوكول ورد في هذا العمل كيفية إجراء الفحص الاسم مع بروتين كامل طول أو إصدار اقتطاع لها تفتقر المجال N-المحطة الأساسية، سواء المختصة كما الأحماض النووية المحرمين، وكيفية تقييم تثبيط NC النشاط كوصي من قبل خيوط intercalator. وعلاوة على ذلك، الاسم يمكن أن يؤديها في وضعين مختلفة، من المفيد الحصول على مؤشرات حول آلية المفترضة عمل مثبطات NC التي تم تحديدها.
Introduction
البروتين قفيصة منواة NCp7 (NC) من فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (HIV-1) هو والبروتين الأساسي الصغير الذي يرتبط بشكل وثيق مع RNA الجيني في الفيروسات المعدية ناضجة، ولعب دورا محوريا في تكاثر الفيروس بمثابة العامل المساعد خلال النسخ العكسي والاعتراف الجينوم، والتعبئة والتغليف. 1-3 NC بمثابة كوصي الحمض النووي تحفيز زعزعة استقرار الهياكل الحمض النووي والصلب من تسلسل التكميلية. نشاطها الحمض النووي تجميع يقيم في المقام الأول في الأحماض الأمينية 11 نطاق N-المحطة في حين تم تعيين النشاط زعزعة استقرار دوبلكس للهياكل إصبع الزنك لها (12-55 الببتيد). 4 البروتين موجبة الشحنة يقلل من الحاجز الكهربائي من رد فعل الصلب و يزيد من المعدل الذي اثنين من سلاسل تكميلية منفصلة معا.
الأحماض النووية مطوية في التشكل مستقرة وتتطلب أنشطة كوصي من NC إلى facilitatالبريد الصلب من 5 وهذا أمر مهم لا سيما في النسخ العكسي، حيث NC أمر بالغ الأهمية في نقل الأحداث حبلا: في نقل ناقص حبلا، وDNA توقف ناقص حبلا، retrotranscribed فقط، يجب أن يتم نقل وصلب لتسلسل مكمل في المنطقة R في 'نهاية 3 من الجينوم RNA القالب. 6 على الرغم من أن يفضل الديناميكا الحرارية، لا يحدث هذا التفاعل على نطاق واسع في غياب NC بسبب وجود هيكل مستقر في المنطقة استجابة تفعيل المتحولة (TAR) RNA في المناطق R، يجب أن تكون مرتبطة إلى نسخة الحمض النووي (DNA cTAR). 7 مناطق هي، في الواقع، منظم للغاية cTAR وTAR ذات صفة الجذعية حلقة التشكل. البروتين NC يبدل طبيعة هذه دبابيس الشعر، ويعزز نقل حبلا ناقص عن طريق زيادة معدل الصلب الجزيئات بين التكميلية جدائل الحمض النووي. وقد تم التحقيق آلية NC الصلب من تقرير التقييم الثالث وcTAR بدقة وديمكتوب كما فحص TAR الصلب في العديد من الأوراق البحثية ويصور الخطة المقترحة في الاستعراضات ممتازة. 8-11 التلخيص، NC يزعزع استقرار هيكل الثانوي من الحمض النووي الريبي مستقر مثل TAR-RNA، يزعزع استقرار هيكل الثانوي للتسلسل التكميلي، cTAR-الحمض النووي ، ويعزز رد الفعل الصلب من RNA / DNA مما يؤدي إلى TAR / cTAR تشكيل مضاعف متغاير. 10،11 ونتيجة لذلك، يفضل الخطوة حبلا نقل أثناء النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية. 12
NC غير هدفا جذابا لتطوير العوامل المضادة للفيروسات جديد منذ ان التداخل المحتمل الناجم عن جزيئات صغيرة نحو NC يؤدي إلى الحد من النسخ العكسي من الجينوم الفيروسي نتيجة لنشاط NC خطر. 2،13 يمكن هذا النهج تؤدي في النهاية إلى تطوير عوامل نجاح مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. في سياق عملية غربلة لNC مثبطات 14 ضعنا مقايسة الاعتماد على الخصائص المعروفةمن قفيصة منواة لزعزعة استقرار بكفاءة ويصلب [أليغنوكليوتيد التكميلية. نحن 10،11 يطلق عليه ucleocapsid N A nnealing- M ediated E lectrophoresis (NAME) فحص. يستخدم اسما وفحص NC للتوسط في الصلب بين نسخ منظم ثابت من الأحماض النووية التكميلية، في حالتنا من قليل النوكليوتيد الموافق الجزء القمي من سلسلة TAR-RNA مع تسلسل الحمض النووي لها التكميلي (cTAR) لانتاج الهجين TAR / cTAR مضاعف متغاير . ويمكن التحقيق في تحليل تقرير التقييم الثالث / cTAR الصلب رد الفعل في وجود NC التي كتبها الأصلي الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (PAGE).
ويظهر هذا البروتوكول كيفية إجراء الفحص الاسم ليصلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة [أليغنوكليوتيد مطوية في الهياكل منعطف حاد مستقرة، وكيفية تحليل نتائج تفاعل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكنا من التجربة. لا يطلب وضع العلامات المشع للحامض النووي، وdetectiعلى العصابات قليل النوكليوتيد يمكن أن يقوم بها وسائل تلطيخ التقليدية. الفحص، التي توظف إما المؤتلف بروتين كامل طول أو نسخة تركيبية اقتطاع من NC، يسمح بتحديد intercalators خيوط تثبيط NC، وهو نشاط تبين أن ترتبط مع ملزمة قوية لRNA والحمض النووي (14).
Protocol
Representative Results
Discussion
الاسم هو الفحص الذي يسمح لتقييم بسرعة تثبيط النشاط كوصي من البروتين قفيصة منواة من HIV-1، هدفا للاهتمام في البحث عن أدوية جديدة لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية. NC anneals سريع في درجة حرارة الغرفة والأحماض النووية التي لولاها لتمسخ الحراري في درجة حرارة عالية تليها الصلب الدقيق للطي مستقر. الفحص لا يمكن أن يؤديها مع أي من كامل طول NC أو مع اقتطاع (12-55) NC: في كلتا الحالتين هي صلب اثنين من الأحماض النووية (RNA ونسخة من DNA التكميلية) بسرعة. وهذا يتفق مع الملاحظة الأدب مع NC الببتيد اقتطاع: يبدأ الصلب من قبل ذوبان كفاءة تنبع من cTAR تليها تفاعل حلقة قمية المكملة له، وهو ضعيف الموقع ملزمة NC، مع تسلسل تكميلية من TAR حلقة قمية، تنتهي خلال عدة سيطة غير مستقرة إلى هجين صلب الموسعة. 21
NC هو البروتوكول الاضافي مستقرة جداعين وبعض المشاكل أثناء أداء الاسم يمكن ان تحدث. من المهم جدا ولكن لإضافة SDS تقدم طازجة في تحميل جل المستخدمة العازلة لوقف رد الفعل: إذا كان هذا لم يتحقق، فإن جل لا تظهر عصابات الحمض النووي في المواضع الصحيحة. في الواقع، NC هو حمض ملزمة البروتين النووي، بحيث لتصور بشكل صحيح TAR / cTAR مضاعف متغاير من قبل الكهربائي للهلام SDS يجب أن تكون موجودة في جل للتحميل العازلة لتفسد البروتين والافراج عنها من مجمعها ضيق مع الأحماض النووية. وهذا هو أيضا استكشاف الأخطاء وإصلاحها ممكن من التجربة، أي تشكيل عصابات تحولت خلال الفترة السابقة هلام. هذا التأثير واضحا بشكل خاص عندما كان يعمل على كامل طول NC، كما في الشكل 2، ويرتبط وجود الذيل N-محطة الأساسي للغاية، وجود تأثير لتجميع قوي على الأحماض النووية.
وجود الذيل الأساسي محطة يجعل رد الفعل الصلب أكثر صعوبة أن يكون مستعمل، كما تظهرن في الشكل (3) باستخدام مركب 1، خيوط intercalator التمثيلية، أي بزيادة intercalator درجة من الكفاءة خاصة في استقرار الهياكل الجذعية حلقة من القطران وcTAR. في الواقع، يفضل هذا النوع من التفاعل مع الأحماض النووية عندما الانتفاخات والحلقات يقطع استمرارية الحلزون المزدوج، مما يسمح للخيوط أسهل من بدائل ضخمة في أزواج قاعدة. استقرار TAR وcTAR من قبل هذه المجلدات الحمض النووي تم تحليلها من قبل تحديد الزيادة في درجة حرارة انصهار من [أليغنوكليوتيد اثنين (14). وعلاوة على ذلك، فإن الزيادة في درجة حرارة انصهار يرتبط مع تثبيط الصلب يحفزه HIV-1 NC، مما أدى إلى تشكيل المخفضة للTAR مضاعف متغاير / cTAR ومما يدل على أن intercalators خيوط هي فئة مثيرة للاهتمام من لدنة لهياكل ديناميكية من RNA مثل عنصر TAR 14
آلية عمل لجأت لهذه كومبوجهاز الأمم المتحدة الإنمائي يمكن التحقق من صحة أبعد عن طريق إجراء فحص الاسم في صيغ بديلة مختلفة، كما هو مبين في الشكل (4): في حالة intercalators تتعزز تثبيط مضاعف متغاير صلب عند المحتضنة المخدرات مع اثنين من oligos مطوية. المركبات التي تعمل مع آلية مختلفة للعمل، مثل المواد اللاصقة مباشرة من البروتين NC، ستكون أقل تأثرا وضع حضن مسبق مختلف. اسم الفحص التي أجريت في طريقتين بالتالي يمكن أن تستخدم لفحص المكتبات من المركبات لتحديد مثبطات NC، وكذلك لتقييم آلية المفترضة عمل يضرب إيجابية أثناء البحث عن العقاقير المضادة للفيروس نقص المناعة البشرية تستهدف NC. ومن الواضح أن استخدام هذه التقنيات وحدها عند المطالبة بالتعويض عن آلية عمل محددة من مثبطات NC حددت ليست كافية، وهناك حاجة أخرى فحوصات الكيمياء الحيوية المناسبة للحفاظ على فرضية العمل (14).
وأخيرا، فإنه يجب التأكيد على أن الاسم يستخدم للغايةالانزيمات المنقى، إما المؤتلف أو الاصطناعية، وإعطاء المعلومات الثمينة على "في المختبر" تثبيط NC بواسطة مركبات اخضعت للاختبار. هذا هو "القوة والضعف" للمقايسة: الاسم يمكن أن تكمل أيضا فحص الظاهري ونهج النمذجة الجزيئية في الخطوات الأولية لبرامج اكتشاف الأدوية، مما يتيح لبناء بسرعة وتحليل العلاقات هيكل النشاط في نهاية المطاف إعادة توجيه التوليف والمخدرات التصميم. لكن، وكما فحوصات الكيمياء الحيوية الأخرى المستخدمة في مشاريع التنمية المخدرات في فيروس نقص المناعة البشرية، اسم لن تعطي معلومات عن آثار مثبطات المفترضة في الخلايا المصابة بالفيروسات.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock solution at -20 °C | |
| TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified. | Metabion International AG | Store the stock aliquot at -80 °C | |
| (12-55)NC peptide | EspiKem srl | Store the stock solution at -20 °C | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | Autoclave before use |
| 0.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 121 023 | Autoclave before use |
| Biosphere Filter Tips 0.1-10 µL | Sarstedt | 701,130,210 | |
| Biosphere Filter Tips 2-20 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
| Biosphere Filter Tips 200 µL | Sarstedt | 70,760,213 | |
| Syringe Filter 0,22 µm | Biosigma srl | 51,798 | |
| Ethanol | Carlo Erba | 414631 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | 71725-50G | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-1L | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71376-1KG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252-2.5KG | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Magnesium Perchlorate | Sigma-Aldrich | 222283-100G | Store the 1M solution at -20°C |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49770-1L | |
| Bromophenol Blue | GE Healthcare Life Sciences | 17-1329-01 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281-100ML | |
| Ammonium Persulfate | Sigma-Aldrich | A7460-500G | Prepare the 10% solution freshly before use |
| Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) | Merck Millipore | 1006401000 | Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting |
| Tris ultrapure | Applichem | A1086,1000 | |
| DEPC-treated water | Ambion | AM9922 | |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | 22,621,408 | |
| NanoDrop 1000 spectrometer | Thermo Scientific | ||
| UV-VIS spectrometer Lambda 20 | Perkin Elmer | ||
| Protean II xi Cell | Bio-Rad | 165-1803 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| SybrGreen II RNA Gel Staining | Lonza | 50523 | Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4°C for two weeks |
| Geliance 600 Imaging System | Perkin Elmer |
参考文献
- Druillennec, S., et al. A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).
- Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus. Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).
- Thomas, J. A., Gorelick, R. J. Nucleocapsid protein function in early infection processes. Virus Res. 134, 39-63 (2008).
- Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function. RNA Biol. 7, 724-734 (2010).
- Zeng, Y., et al. Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).
- Basu, V. P., et al. Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription. Virus Res. 134, 19-38 (2008).
- Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA. J Virol. 71, 5178-5188 (1997).
- Godet, J., Mely, Y. Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein. RNA Biol. 7, 687-699 (2010).
- Darlix, J. L., et al. Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).
- Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1. Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).
- Vo, M. -. N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).
- Beltz, H., et al. Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis. J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).
- Mori, M., et al. Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1. Curr Top Microbiol Immunol. , .
- Sosic, A., et al. Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors. MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).
- Tabarrini, O., et al. Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives. Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).
- Hagan, N., Fabris, D. Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element. 生化学. 42, 10736-10745 (2003).
- Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease. Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).
- Zagotto, G., et al. Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates. Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).
- Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution. Chem Biol. 10, 663-672 (2003).
- Gooch, B. D., Beal, P. A. Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides. J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).
- Kanevsky, I., et al. Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).
