Желчного протока Лигирование у мышей Индукция воспалительного печени травматизма и фиброза обструктивной холестаза
概要
Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.
Abstract
В большинстве позвоночных, печень вырабатывает желчь, которая необходима для эмульгирования всасываться жиры и позволяют переваривание липидов в тонком кишечнике, а также выводить билирубин и другие продукты обмена веществ. В печени, экспериментальный обструкция внепеченочных билиарной системы инициирует сложный каскад патологических событий, что приводит к холестаз и воспаление в результате сильного фиброзной реакцией, происходящих из перипортальных полей. Таким образом, хирургическая перевязка общего желчного протока стала наиболее часто используемая модель, чтобы вызвать обструктивного холестатическое травмы у грызунов и изучать молекулярные и клеточные события, лежащие в основе этих патофизиологических механизмов, вызванные неадекватной желчи. В последние годы, различные хирургические методы были описаны, что либо позволить повторное соединение или reanastomosis после лигирования желчного протока (BDL), например, частичное BDL или другие микрохирургические методы для конкретных исследовательских вопросов, Тем не менее, наиболее часто используется модель полной обструкции общего желчного протока, который вызывает сильное фиброзной ответ после 21 до 28 дней. Смертность может быть высокой из-за инфекционных осложнений или технических неточностей. Здесь мы предлагаем подробную хирургическую процедуру для модели BDL у мышей, которые вызывают весьма воспроизводимый фиброзной ответ в соответствии с правилом 3R защиты животных постулированному Рассел и Берч в 1959 году.
Introduction
Фиброз печени определяется как чрезмерное производство и накопление внеклеточного матрикса (ЕСМ), который происходит из сложной сети взаимодействий матричных по производству звездчатых клеток печени и широкого круга печени-резидентов и проникают клетки клеток крови 1,2. Хотя фиброз печени может быть вызвана множеством различных раздражителей молекулярные механизмы, лежащие в основе фиброза как правило, очень похожи. После поражения печени, очень организованная программа молекулярных и клеточных изменений инициируется. В этой программе тесное взаимодействие между воспалительных сигналов, моноцитов / макрофагов и звездчатых клеток печени происходит, что в конечном итоге приводит к активации звездчатых клеток и трансдифференцировки к миофибробластов, отложение ECM и последовательных анатомических и функциональных изменений в печени целостности тканей 3. Активация звездчатых клеток печени, в частности, обусловлено воспалительными сигналов и взаимодействия с заболеваниями печениЖилой макрофаги (т.е. клеток Купфера). Возбудитель связанные молекулярные модели признаны специализированных распознающих рецепторов, таких как Toll-подобных рецепторов, которые при активации сигнала через сложную сеть различных путей, которые вызывают экспрессию и секрецию множества воспалительных цитокинов и хемокинов, которые приводят в воспалительный процесс 3. Воспалительная реакция и образуется в печени оскорбление только временно, когда фактор болезни производстве удаляется. В отличие от этого, если травма сохраняется, хроническое воспаление развивается в печени и экспрессии и накопления ECM толпы на переднем плане в результате прогрессирующей замещения нормальной паренхимы печени путем образования рубцовой ткани.
С печени фиброгенез у людей во всем мире клиническая проблема, несколько экспериментальных моделей на грызунах острой и хронической печеночной недостаточности были созданы в течение последних десятилетий. В мюСистема Rine например, общие модели введение множества различных гепатотоксины, лигирование общего желчного протока, индукция повреждений печени иммуно-опосредованной и целевые введение генных дефектов или наоборот избыточная экспрессия трансгенов, которые влияют на критическое сигнальных путей, вовлеченных в патогенез фиброза печени 4.
Лигирование общего желчного протока у грызунов была проведена в качестве экспериментальной процедурой, описанной в исследований в течение многих лет 5-8. Первый высокую воспроизводимость протокол для длительной желчных протоков лигирования (BDL) у грызунов уже была представлена в настоящее время более чем три десятилетия назад 9. В этом протоколе как катетеризации / обструкции и сшивка улучшает высокий выход цирроза у крыс с морфологических изменений, которые были сравнимы с наблюдаемыми в билиарный цирроз печени человека 9. Соответствующий протокол является простым, хирургическая процедура относительно быстро применимо, А выживаемость животных высокие и более 95%. В классической протокола крысы катетеризации / препятствий, короткий разрез 2 см производится чуть ниже мечевидного отростка. После этого канюли вставляется в проксимальной части желчного протока и фиксируется в своей позиции с шелковыми швами. На следующем этапе, дистальная часть канюли затруднен 3 узлов, положить через нижний конец срединный разрез и захоронены подкожно в правом нижнем квадранте 9. В конце концов, живот закрыты, и животным позволяют восстановиться. В протоколе лигирования, крыс подвергают двойной перевязки общего желчного протока с или без вскрытия желчного протока между лигатурами 9.
Это экспериментальная модель хорошо принята и используется во всем мире в сотнях лабораторий, чтобы вызвать холестаз и фиброза печени. Это вызывает внутрипеченочный билиарный пролиферации эпителиальных клеток, миофибробластической differentiatioп портальных фибробластов вокруг пролиферирующих желчных эпителиальных клеток, что приводит к высокой воспроизводимостью, массивной экспрессии и осаждения ECM 10,11. Таким образом, применение этой модели у крыс и мышей, чтобы быть популярным среди ученых, которые стремятся понять патогенез печеночной воспаления и фиброза.
В нашей лаборатории, мы широко использовали этот протокол в прошлом у крыс в нескольких экспериментальных исследований, направленных на исследование специальных молекулярных и клеточных аспекты печеночной фиброгенезе и проверить новые антифиброзных понятия и наркотики 12-15.
Недавно мы приспособлены эту методику в мышиной системе и обнаружили, что лигирование желчного протока хирургии также является привлекательным для установления среднего времени в зависимости от фиброза с низкой вариации и смертности у мышей 16-18. Из-за меньшего размера животных, однако, некоторые важные изменения в отношении к анестезии, хирургических ПЕРИОДention и наблюдение после лечения необходимы для получения надежных и воспроизводимых результатов в этой модели. Полная адаптация приведены в следующей протокола и в сопроводительном видео документации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cholestatic поражение печени является одним из основных причинных факторов для развития фиброза и цирроза печени у пациентов с хроническими заболеваниями печени. Исходя из того, что эти заболевания производить невесомых расходов на здравоохранение, то понятно, что многие исследователи пытаются понять патогенетические механизмы постоянного фиброза печени. Таким образом, экспериментальные модели были получены, которые имитируют различные аспекты сложных механизмов, которые приводят к печеночной воспаление, фиброз и цирроз печени 1.
Хирургический BDL является одним из самых распространенных экспериментальных моделей, которые используются, чтобы вызвать обструктивного холестатическое травмы у мышей и крыс 4,23,24. В большинстве протоколов, животных анестезируют и мидель лапаротомии выполняется. Впоследствии, желчных протоков раскрыта из брюшной полости и лигировали в два раза с помощью хирургического шпагат. Как следствие, у мышей и крыс, которые получили эту операцию Develop сильный фиброзная реакция, которая в первую очередь исходят из перипортальных полей 25. За годы несколько различных хирургических методов и модификации были описаны. Специальные процедуры даже позволить повторное подключение или reanastomosis после BDL 23. Другие методы основаны на частичном BDL, в результате чего значительно меньше образованием некроза и, следовательно, пролиферации гепатоцитов 24. Частичное BDL в сочетании с последующим удалением желчного пузыря (холецистэктомии), что предотвращает образование холецистита также представляет собой отличную экспериментальную модель для острого холестаза. Было предложено, чтобы быть моделью, которая находится ближе к человеческой ситуации 24. И действительно, во время установления этой модели, было уже продемонстрировал, что воспроизводимо вызывает холестаза при минимальном травмы гистологического ткани и не перейти к хронической холестаза 25. Таким образом, было отмечено, что эта модель идеально подходит для изучения лате эффекты обратной холестаза 24. Еще более сложные методы основаны на микрохирургии и позволяют быстро и воспроизводимым способом, чтобы причинить холестатическая поражения печени только в отдельных частях печени 26.
Хотя эти сложные модификации от оригинального протокола BDL, как было доказано быть очень полезным в расследовании конкретных исследовательских вопросов, многие лаборатории во всем мире в основном направлены на использовании модели BDL как высоко воспроизводимым и надежная модель для холестатическом фиброза печени. Тем не менее, многие осложнения могут возникнуть, которые могли бы существенно изменить воспроизводимость и надежность полученных результатов в рамках этой модели, если технические неточности не избежать. Например, кровотечений, связанных с повреждением кровеносных сосудов, сопровождающих желчный проток (см фиг.3 – 4) может произойти во время или после операции быстро. Передозировка анестезии с последующим cardiodepression или Respiratory отказ также можно избежать осложнения процедуры. Тяжелые инфекции, начиная от перитонита, сепсиса, может произойти в течение всего периода эксперимента, если швы не выполняется точно и утечки желчи в брюшную полость. Случайные травмы кишечника во время операции может привести к перитониту. Таким образом, очевидно, что стандартизированные протоколы, которые в соответствии со строгими руководящими принципами обработки сильно требуется. Это условие также недавно потребовало в странах Европейского Союза, который внедрил новые правила защиты животных в 2013 году 1. Соответствующие требования, связанные с этим Правилам, не являются новыми и уже предложил в 1959 году, когда Рассел и Берч предложили этические рамки для проведения научных экспериментов с животными, главным образом на основе замены, изысканность и восстановление (3R) Принцип 27.
Когда после outlinПротокол ред Есть только несколько осложнений, которые могут возникнуть в результате технических погрешностей. Три конкретные вопросы могут возникнуть в довольно низкой частоты.
Как и во всех хирургических процедур, передозировка анестетика является потенциальным источником опасности для животных, особенно в сочетании с гипотермией. Если во время операции сердечно-сосудистые осложнения возникают, поставка анестетиков следует немедленно прекратить и оператор должен попытаться обеспечить максимально кислорода к мыши. Это может быть сделано с помощью небольшой пластиковый шприц, наполненный воздухом и закачивается в устье нарушенной животного. Кроме того, использование небольшого Peleusball для вентиляции пораженного животного часто бывает полезно для процесса активизации.
Проблемы в заживлении ран
После операции BDL, мыши могут укусить свои собственные швы болят или у других животных. Если это происходит, соответствующие мышей должно быть отдельнов клетке. Животные с открытых ран должны быть под наркозом, область вокруг раны слегка стерилизуют стандартным антисептик, и рана должна быть зашита снова. В течение следующих 3 дней, рана этих животных должны регулярно проверяться (два-три раза в день).
Distensions живота или формирование асцита указывают на бактериальных инфекций. Это может произойти из-за нестерильных работы во время операции. Все виды инфекций следует обращаться без исключения, как гуманной конечной точки и пострадавшие животные должны быть принесены в жертву.
Мы предоставили легко следовать протокол, который позволяет производительность BDL у мышей, которое является простым в реализации и вызывает только низкая смертность животных в сочетании с высокой воспроизводимостью. Все хирургические протоколов можно быстро задержаны квалифицированных ученых. В полной экспериментов животных содержали при потепления пластины при температуре 37 ° С и постоянно подключенк системе анестезии минимизации боли и страдания. Для хирургии брюшной полости открывается с срединной лапаротомии и желчных протоков дважды лигированного, не рассекая ее. Представительные результаты, которые были обсуждены здесь, показывают, что фенотипические изменения в отношении морфологии печени (воспаление, фиброз, цирроз) высокой воспроизводимостью и позволяют изучать различные аспекты фиброгенеза (например., Начало, воспаление, прогрессирование, терминальной стадии болезни) в определенных временных точках.
Мы надеемся, что резюме нашего протокола поможет сократить кривую обучения, которые необходимы, чтобы успешно установить эту фиброз модель в других лабораториях и гарантировать надежные и воспроизводимые результаты в разных местах. Таким образом, мы думаем, что представлено протокол поддерживает принцип 3R, который должен был Рассел и Берч в 1959 году и представляет собой основу новых правил по защите животных, которые в настоящее внедрены во многих странах Wiтонкий Европейская рамочная.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность за финансовую поддержку Немецкого исследовательского фонда (SFB / TRR57, Q3 и Q2). Авторы благодарят Mareike Шульц, Pascal Paschenda и Klaudia Warzecha за помощь в подготовке фотографий.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
| Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Scotch Tape | commercially available | ||
| Tissue paper | commercially available | ||
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| 6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
| Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
| 25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
| 5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
| 5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
| 1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |
参考文献
- Liedtke, C., et al. Experimental liver fibrosis research: update on animal models, legal issues and translational aspects. Fibrogenesis Tissue Repair. 6 (1), 19 (2013).
- Aller, M. A., Arias, J. L., García-Domínguez, J., Arias, J. I., Durán, M., Arias, J. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 6 (2008).
- Tacke, F., Weiskirchen, R. Update on hepatic stellate cells: pathogenic role in liver fibrosis and novel isolation techniques. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 67-80 (2012).
- Weiler-Normann, C., Herkel, J., Lohse, A. W. Mouse models of liver fibrosis. Z. Gastroenterol. 45 (1), 43-50 (2007).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. J. Pathol. 35 (5), 769-798 (1932).
- Cameron, G. R., Hasan, S. M. Disturbances of structure and function in the liver as the result of biliary obstruction. J. Pathol. 75 (2), 333-349 (1958).
- Accatino, L., Contreras, A., Fernańdez, S., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile flow and bile acid excretion: postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 93 (5), 706-717 (1979).
- Accatino, L., Contreras, A., Berdichevsky, E., Quintana, C. The effect of complete biliary obstruction on bile secretion. Studies on the mechanisms of postcholestatic choleresis in the rat. J Lab Clin Med. 97 (4), 525-534 (1981).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Tuchweber, B., Desmoulière, A., Bochaton-Piallat, M. L., Rubbia-Brandt, L., Gabbiani, G. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74 (1), 265-278 (1996).
- Desmoulière, A., et al. Extracellular matrix deposition, lysyl oxidase expression, and myofibroblastic differentiation during the initial stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 76 (6), 765-778 (1997).
- Arias, M., et al. Adenoviral expression of a transforming growth factor-β1 antisense mRNA is effective in preventing liver fibrosis in bile-duct ligated rats. BMC Gastroenterol. 3 (29), (2003).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Dominant-negative soluble PDGF-β receptor inhibits hepatic stellate cell activation and attenuates liver fibrosis. Lab. Invest. 84 (6), 766-777 (2004).
- Borkham-Kamphorst, E., Huss, S., Van de Leur, E., Haas, U., Weiskirchen, R. Adenoviral CCN3/NOV gene transfer fails to mitigate liver fibrosis in an experimental bile duct ligation model because of hepatocyte apoptosis. Liver Int. 32 (9), 1342-1353 (2012).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. The anti-fibrotic effects of CCN1/CYR61 in primary portal myofibroblasts are mediated through induction of reactive oxygen species resulting in cellular senescence, apoptosis and attenuated TGF-β signaling. Biochim. Biophys. Acta. 1843 (5), 902-914 (2014).
- Huss, S., et al. Development and evaluation of an open source Delphi-based software for morphometric quantification of liver fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 3 (1), 10 (2010).
- Borkham-Kamphorst, E., Drews, F., Weiskirchen, R. Induction of lipocalin-2 expression in acute and chronic experimental liver injury moderated by pro-inflammatory cytokines interleukin-1β through nuclear factor-κB activation. Liver Int. 31 (5), 656-665 (2011).
- Karlmark, K. R., et al. The fractalkine receptor CX3CR1 protects against liver fibrosis by controlling differentiation and survival of infiltrating hepatic monocytes. Hepatology. 52 (5), 1769-1782 (2010).
- Tarcin, O., et al. Time course of collagen peak in bile duct-ligated rats. BMC Gastroenterol. 11, 45 (2011).
- Takase, S., Leo, M. A., Nouchi, T., Lieber, C. S. Desmin distinguishes cultured fat-storing cells from myofibroblasts, smooth muscle cells and fibroblasts in the rat. J. Hepatol. 6 (3), 267-276 (1988).
- Borkham-Kamphorst, E., et al. Protective effects of lipocalin-2 (LCN2) in acute liver injury suggest a novel function in liver homeostasis. Biochim. Biophys. Acta. 1832 (5), 660-673 (2013).
- Labbus, K., et al. Proteomic profiling in Lipocalin 2 deficient mice under normal and inflammatory conditions. J Proteomics. 78, 188-196 (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J. Surg. Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Scholten, D., et al. Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice. Gastroenterology. 139 (3), 987-998 (2010).
- Aller, M. A., et al. A half century (1961-2011) of applying microsurgery to experimental liver research. World J Hepatol. 4 (7), 199-208 (2012).
- Russell, W. M. S., Burch, R. . The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
