Yetiştirme<em> Heligmosomoides Polygyrus:</em> Bir immunsupresif Nematodu Parazit ve Salgılanmış Ürünleri

NOT: Bu protokol tüm işlemler Birleşik Krallık Home Office ve Edinburgh Veteriner Hizmetleri Üniversitesi tarafından belirlenen esaslara uygun olarak yapılır. Gavaj yoluyla 1. Farelerin enfeksiyonu Altı aya kadar 4 ° C için damıtılmış su içinde mağazası Heligmosomoides polygyrus L3 larva. Kullanmadan önce, damıtılmış su içinde L3 larva üç kez yıkayın: santrifüj (fren) 10 dakika boyunca 300 x g'de, tüm su ancak 500 ul çıkarın (rahatsız edici pelet L3 larva önlemek için) ve pelet, her zaman yeniden süspanse edin. Üçüncü yıkama için, kendi deliği genişletmek için 200 ul ucu kesilmiş tam bir hacimde (tipik olarak 40 mi) ve aspirasyon 20 ul su ilave edilir. (Mobil, ve en iyi bir mikroskop ile 50X büyütme altında inceledi genellikle) 60 mm kültür çanak yüzeyinde iki 20 ul örnekleri yerleştirin ve L3 larva sayısı. Bir concentratio için damıtılmış su içinde nihai pelet yeniden süspanseml başına 2,000 L3 larvaları n. Yaşam döngüsü üretimi için, 400 H. 8 haftalık F1 (C57BL / 6xCBA) fareleri enfekte oral gavaj yoluyla damıtılmış su, 200 ul polygyrus L3 larvalarına (Boynun ense göre dik olarak fareler sınırlayacağı ve yavaşça mideye ağızdan ve yemek borusundan küt gavaj iğnesi). Çalkalayın, her enfeksiyon (larvalar suda hızlı yerleşmek) ve aspirat 1 ml şırınga 200 ul önce iyice; yuvarlak uçlu özel bir sonda iğne kullanın. Genç farelerde deneysel enfeksiyon (6-8 hafta) veya diğer doğal suşları (örneğin, C57BL / 6 veya Balbc) için, 200 L3 larva ile enfekte fareler. 2. Yayılım ve H. Bakım polygyrus Büyük bir plastik küvet merkezinde kömür yerleştirin ve soğuk musluk suyu 30 dakika en az üzerinde çalışmasına izin (yıkanmamış aktif kömür L3 larvalarına karşı toksiktir). Küvet suyu boşaltın ve t kömür yerleştirinTamamen kuruyana kadar oda havaya maruz kalacak şekilde, emici kağıt tabakaları, wo. Yumurta gerekiyorsa (gerekirse ve makas), ilk forseps ile kolonun dışına dışkı kazımak. L3 larva sayıda gerekli ise, bir tel ızgara üzerinde fareler yerleştirin ve bir kaç gün içinde fekal pelet toplar. Sadece kağıt filtre yapışmak için yeterince nemli bir kıvam elde etmek için, 1: en az bir 1 oranında granüle edilmiş mangal kömürü ile dışkı karıştırın. Bir petri bazı nemli filtre kağıdının ortasına ince bir tabaka smear ve nemli kutuda bu koyun 12-14 gün süreyle karanlıkta (bazı nemli kağıt havlu ve su bir tabak eklemek). Itibaren günde 7 den L3 larvaları çıkarın ve kağıt atılır önce en az iki vesilelerle onları toplamak. Larvalar filtre kağıdı kenarı etrafında bir halka oluştururlar; petri üzerinden filtre kağıdı kaldırarak ve 50 ml'lik bir tüp içine (bir pipet ve plaka başına steril su 5 ml kullanılarak) levhanın kalan larva yıkayın. Asansörve filtre kağıdı kapalı kalan larvalar 50 ml tüp içine damıtılmış su ile tabağın sol hasat. 10 dakika için 300 xg'de atık çözüm santrifüjleyin. Damıtılmış su ile larva üç kez yıkayın ve gerekli olana değin daha sonra damıtılmış su içinde 50 ml 4 ° C'de saklayın. NOT: Larva canlı kalır ve en az 6 ay süreyle enfektif. Yetişkin H. 3. Koleksiyonu polygyrus Worms Şekil 1'de gösterildiği gibi önceden değiştirilmiş Baermann Aparatı hazırlayın. On dört gün sonra enfeksiyon itlaf fareler. % 70 etanol ile karın yıkayın. Karın üzerindeki deriyi kesin ve karın ön duvarı ortaya çıkarmak için geri çekin. Periton boşluğuna girmek için orta hat kesi olun. (Distal rektum proksimal duodenum itibaren) tüm küçük ve büyük bağırsak çıkarın. Kuru Petri kabı içine yerleştirin. Onun bütün uzunluğu boyunca gut Düzelt; dışkı içeren kolon tüketim; Daha sonra yumurta hazırlıkları için ayrı bir çanak içine bu yerleştirin. Nedeniyle içi lümen solucanlar duodenum ve genellikle kırmızı görünüm nispeten kalın bir duvar ile -identified erişkin solucanlar içeren ince bağırsağın proksimal 20 cm eksize edin. Hanks çözeltisi, 5 ml ile (100 mm'lik çap) Petri kabı içine yerleştirin, 37 ° C (tabak başına iki örnek) ısıtıldı. Makas (yuvarlak uçlu makas bunun için en iyi) ile uzunlamasına solucan dolu proksimal bağırsak bölümünü açın ve solucanları kaldırmak için iki cam slaytlar ile astar bağırsak içinde aşağı kazımak. Sonra temiz bağırsak duvarını atın. Küçük müsli çanta içine ucu solucanlar, zımba kapalı ve cam huni (Şekil 1) kenarında Ataç ile sabitleyin. Hanks 'Çözüm ile huni doldurun ve her huni içine solucanlar yaklaşık 4 Petri kapları ekleyin. 1-2 saat boyunca 37 ° C inkübatör içinde bir yer cihaz, hafifçe yarı yoldan ajite çıkarmak içinmuslin filtresi occlude bağırsak hazırlık enkaz. Muslin çanta dışında enkaz dökülmesini önlemek için özen – bu son HES hazırlık kontaminasyona neden olur. Yetişkin solucanlar yavaş yavaş muslin kumaş ile göç ve cam test tüpünün dibinde yerleşmiş olmalıdır. Dikkatle (bu noktada solucanlar kaybetmemek için dikkat) lavabonun üzerinde bağlantı kauçuk hortum test tüpü ayırın. Bir plastik pipet kullanarak, bir 50 ml tüp içine solucanlar aktarmak ve yıkama altı kez Hanks ile 'Çözüm (solucanlar bir stripette ile medya, yerçekimi ile yerleşmek kaldırmak için izin eklemek Hanks 40 ml' Çözüm ve beş kez tekrarlayın). Not: solucan kültürü Bu noktadan itibaren, steril tutulmalıdır. Bir laminar akış çeker taşı ve 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin, in vitro kültür için hazır ile takviye edilmiş steril Hanks çözeltisi içinde altı defa yıkanır. Saymakonun açıklığı genişletmek için sarı ucu kesilmiş alınmış 20 ul iki numune alarak kurtarıldı erişkin solucanlar; aşılanmış larva miktarı yaklaşık% 50 bekliyoruz. Orta Hazırlanması, Yetişkin Worms Yıkama: 4. HES için Kültürleri Kurma RPMI yaklaşık 10 ml 3.11 solucanlar emmek solucanlar tamamen kapalı sağlamak için bir açıyla boru dinlenme bırakarak, 20 dakika boyunca% 10 Gentamisin ile takviye edilmiştir. Bir laminar akış başlığı içinde bu yapın: Hanks çözeltisi ile altı kez yıkama (5 U ile takviye / ml penisilin ve 5 ug / ml streptomisin). H. hazırlayın polygrus ortam. , 11.1 mi,% 45 glükoz (nihai konsantrasyon RPMI-1640,% 0.2 glukoz içeren 1.2%), 100 x Peniclllin-Streptomisin (nihai konsantrasyon, 5 U / ml penisilin, 5 ml ilave edin, 500 RPMI1640 ml, bir laminar akış başlığı içinde steriliteyi korumaya 5 ug / ml streptomisin), L-glutamin, 5 ml (nihai konsantrasyon 2 nM), veGentamisin 5 ml (nihai konsantrasyon% 1). FCS katmayın. Bacalı T25 şişeler içine kısım solucanlar, yakl. 15 mi H. 1000 solucanlar polygyrus şişe başına ortam, ve 37 ° C inkübatör (% 5 CO2) 3 hafta boyunca dik bir yer. HES 5. hazırlanması Kültür 24 saat sonra ilk koleksiyonunu bir kenara bırakarak, haftada iki kez daha daha uzun aralıklarla kültürlerinden kültür ortamı HES içeren toplayın (LPS nedeniyle kirlenme ve ev sahibi proteinlerin yüksek düzeyde – ayrı ayrı işlenir veya atılabilir). Ayrı ve açıkça tarih ve seri numarası ile etiketlenmiş her koleksiyonu tutun. H. eşit hacimde yerine Her vesileyle polygyrus medya. Santrifüj 5 dakika boyunca 400 x g 'daki ortamı HES-ihtiva etmektedir. Daha sonra 50 ml tüpler içinde 0.2 mikron düşük-protein bağlayıcı filtre ile sterilize filtre edin. -20 ° C derin dondurucuda saklayın açıkça HES c solucan hasat tarihi ve tarih ile etiketlenmişollection. Kültürden HES toplama 21 gün sonra, solucanlar atın. (Genellikle dondurulmuş stoktan ve ilk 24 saat toplama dahil olmak üzere) ve azot basıncı altında, ultrafiltrasyon cihazında 3000 MWCO filtre üzerinde konsantre HES yüzer Havuz 500-1000 mi. NOT: Filtre çalışma kuruması için çok dikkatli olun. Filtre cihazı kurmak ilk karıştırma iken 3 x 20 dakika boyunca distile su ile 1 litrelik beher aşağı 3 kDa membran parlak tarafı yıkamak için. Filtre membran parlak tarafı yukarı üreticinin talimatlarına göre ultrafiltrasyon cihazı monte edin. 4 ° C 'de kabin içinde yeri ve bir araya toplanmış HES konsantre başlamadan önce damıtılmış su, 50 ml geçmektedir. Hacmi 2-5 ml'ye kadar konsantre edildi kadar (gün başına 100-140 mL) gerektiği gibi süzme cihazına HES her tüp ekleyin. PYR 50 ml HES-ihtiva eden kültür ortamından kirleri çıkarmak eklemek içinve PBS filtrasyon cihazına ve ogen-özgür sonra yaklaşık 2 ml kadar konsantre. İki kez bu adımı (toplam PBS 150 mi) tekrar edin. Bir laminar akış başlığı içinde bir 15 ml tüp (0.2 um filtre ile) filtre ile steril olarak HES aktarın ve bir spektrofotometre (= 10 e 280) ya da Bradford tahlili ile kullanılarak protein konsantrasyonları ölçülür. Kısım, -80 ° C'de parti numarası ve tarih, ve dondurma ile etiket. Kullanımdan önce HES her parti üzerine, üreticinin protokollerine uygun olarak, bir kromojenik olan LAL değerlendirmesinin kullanılması yapın. LPS seviyelerinin 1 ug protein başına 1 u, LPS daha büyük ise, in vivo deneyler için ya da in vitro kültürlerde bu serisi ile düşünün. Ayrı ayrı, aynı şekilde 24 saat sonra toplanan HES Proses; uygun olmayan fonksiyonel deneyler için, bu monoklonal antikor, afinite temizliği yolu ile izole edilebilir tek tek moleküllerin bir yararlı bir kaynak olduğunu da bunun, LPS ve bir ev sahibi proteinleri ihtiva edecektir. </ol>