Coltivazione di<em> Heligmosomoides polygyrus:</em> Un immunomodulante nematode parassita ei suoi prodotti secreti

NOTA: Tutte le procedure di questo protocollo vengono eseguite in conformità con le linee guida stabilite dal Regno Unito Home Office e l'Università di Edimburgo Servizi Veterinari. 1. L'infezione di topi Gavage Conservare Heligmosomoides polygyrus L3 larve in acqua distillata per fino a sei mesi a 4 ° C. Prima dell'uso, lavare L3 larve tre volte in acqua distillata: centrifugare a 300 xg per 10 min (con freno), rimuovere tutti ma 500 ml di acqua (per evitare di disturbare pellettato larve L3) e risospendere il pellet ogni volta. Per il terzo lavaggio, aggiungere acqua per un volume esatto (tipicamente 40 ml) e aspirare 20 l con 200 microlitri punta tagliata per allargare la sua apertura. Inserire due campioni 20 microlitri sulla superficie di un piatto di coltura 60 mm e contare il larve L3 (generalmente mobili, e meglio visto sotto ingrandimento 50X con un microscopio da dissezione). Risospendere il precipitato finale in acqua distillata ad una concentration 2.000 L3 larve per ml. Per la produzione del ciclo di vita, infettare da 8 settimane di età F1 (C57BL / 6xCBA) topi con 400 H. polygyrus L3 larve in 200 ml di acqua distillata da sonda gastrica (frenare topi in posizione verticale per la collottola e passare delicatamente l'ago sonda gastrica smussato attraverso la bocca e l'esofago nello stomaco). Agitare accuratamente prima di ogni infezione (larve stabilirsi rapidamente in acqua) e aspirare 200 microlitri in una siringa da 1 ml; utilizzare un ago sonda gastrica dedicato con un'estremità arrotondata. Per infezione sperimentale di topi più giovani (6-8 settimane), o di altri ceppi inbred (ad esempio C57BL / 6 o BALBc), infettare topi con 200 L3 larve. 2. Propagazione e manutenzione di H. polygyrus Inserire carbone nel centro di una grande vasca di plastica e lasciare acqua di rubinetto fredda per eseguire su di esso per un minimo di 30 min (non lavati carbone attivo è tossico per le larve L3). Scaricare l'acqua dalla vasca e posizionare il carboncino su two strati di carta assorbente, lasciando esposta all'aria stanza fino a completa asciugatura. Se le uova contenute, raschiare feci prima fuori del colon con una pinza e forbici (se necessario). Se è necessario un gran numero di larve L3, posizionare topi su una griglia metallica e raccogliere pellet fecali per diversi giorni. Mescolare le feci con carbone granulato con un rapporto di almeno 1: 1, per ottenere una consistenza appena sufficiente per smorzare aderire filtrare carta. Spalmare uno strato sottile sul centro di una carta da filtro inumidita in una capsula di Petri e collocarlo in una scatola umida (aggiungere qualche tovagliolo di carta umido e un piatto di acqua) al buio per 12-14 giorni. Rimuovere L3 larve dal giorno 7 in poi, e raccoglierli in almeno due occasioni, prima che la carta viene scartata. Le larve formano un anello attorno al bordo della carta da filtro; sollevare la carta da filtro dalla capsula di Petri e sciacquare le larve che restano della piastra (utilizzando una pipetta e 5 ml di acqua sterile per piastra) in un tubo da 50 ml. Ascensorela carta filtro e raccogliere le larve rimanente lasciato sul piatto con acqua distillata in un tubo da 50 ml. Centrifugare la soluzione effluente a 300 xg per 10 min. Lavare le larve tre volte con acqua distillata e quindi memorizzare a 4 ° C fino a 50 ml di acqua distillata fino all'utilizzo. NOTA: Le larve rimangono vitali e infettiva per almeno 6 mesi. 3. Raccolta di adulti H. polygyrus Worms Preparare la Apparato Baermann modificata anticipo, come mostrato in Figura 1. Topi Cull quattordici giorni dopo l'infezione. Lavare l'addome con il 70% di etanolo. Tagliare la pelle sopra l'addome e tirare indietro per rivelare la parete addominale anteriore. Fare incisione mediana di entrare nella cavità peritoneale. Rimuovere l'intero intestino tenue e crasso (dal duodeno prossimale a distale del retto). Mettere in una capsula di Petri a secco. Raddrizzare l'intestino tutta la sua lunghezza; asportare il colon feci contenenti; collocare questo in un piatto a parte per i preparati a base di uova successive. Accise L'prossimali 20 cm di intestino tenue che contiene i vermi adulti -identified dal relativamente spessa parete del duodeno e spesso un aspetto rosso a causa dei vermi intra-luminali. Mettere in un (diametro 100 mm) piastra di Petri con 5 ml di soluzione di Hanks ', riscaldato a 37 ° C (due esemplari per piatto). Aprire la porzione prossimale dell'intestino verme pieno longitudinalmente con le forbici (forbici rotonde-ended sono i migliori per questo), e raschiare giù all'interno del rivestimento intestinale con due lastre di vetro per rimuovere il worm. Poi scarta parete intestinale pulito. Worm punta in piccoli sacchetti di mussola, fiocco chiuso e sicuro con graffette intorno al bordo del imbuto di vetro (Figura 1). Riempire imbuto con Solution Hanks 'e aggiungere circa 4 piastre di Petri di vermi in ciascun cilindro. Collocare il dispositivo in 37 ° C incubatore per 1-2 ore, agitando delicatamente metà a sloggiaredetriti dalla preparazione dell'intestino che può occludere il filtro di mussola. Fare attenzione ad evitare la fuoriuscita di detriti di fuori del sacchetto di mussola – questo farà sì che la contaminazione della preparazione finale HES. Vermi adulti devono hanno lentamente migrate attraverso il panno di mussola e depositato sul fondo della provetta di vetro. Staccare con cautela la provetta dal tubo di gomma di collegamento sopra il lavandino (avendo cura di evitare di perdere i vermi a questo punto). Utilizzando una pipetta di plastica, trasferire i vermi in un tubo da 50 ml e lavare sei volte con Hanks 'Solution (permettono vermi di stabilirsi con la gravità, rimuovere il supporto con un stripette, aggiungere 40 ml di Hanks' Solution e ripetere cinque volte). NOTA: la cultura verme deve essere mantenuto sterile da questo punto in poi. Spostare una cappa a flusso laminare e lavare altri sei volte in soluzione sterile Hanks 'integrato con 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina, pronta per la cultura in vitro. Contare ilvermi adulti recuperati prendendo due campioni di 20 l scattate con una punta taglio giallo di ampliare la sua apertura; aspettarsi circa il 50% della quantità di larve inoculato. 4. Configurazione culture per HES: Media Preparazione, lavaggio vermi adulti Immergere i vermi di 3.11 in circa 10 ml di RPMI supplementato con 10% Gentamicina per 20 minuti, lasciando il riposo tubo ad angolo per garantire vermi sono completamente coperti. Eseguire questa in una cappa a flusso laminare: sciacquare sei volte con soluzione di Hanks '(supplementato con 5 U / ml di penicillina e 5 ug / ml di streptomicina). Preparare H. supporti polygrus. Il mantenimento della sterilità in una cappa a flusso laminare, a 500 ml di RPMI1640, aggiungere 11,1 ml di 45% di glucosio (concentrazione finale 1,2% come RPMI1640 contenente 0,2% di glucosio), 5 ml di 100x Peniclllin-streptomicina (concentrazione finale 5 U / ml di penicillina, 5 ug / ml di streptomicina), 5 ml di L-glutammina (concentrazione finale 2 mM), e5 ml di gentamicina (concentrazione finale 1%). Non aggiungere FCS. Worm aliquotare in fiaschi T25 ventilati, c. 1.000 vermi in 15 ml H. polygyrus supporto per bombola, e posto in posizione verticale in 37 ° C incubatore (5% di CO 2) per 3 settimane. 5. Preparazione di HES Raccogliere HES contenenti coltura da colture ad intervalli di non più di due volte alla settimana, mettendo da parte la prima collezione dopo 24 ore di cultura (a causa di elevati livelli di contaminazione LPS e proteine ​​dell'ospite – possono essere trattati separatamente o scartato). Tenere ogni raccolta differenziata e chiaramente etichettati con la data e il numero lotto. Sostituire con un uguale volume di H. polygyrus supporto in ogni occasione. Centrifuga HES contenenti supporti a 400 x g per 5 min. Poi filtrare sterilizzare attraverso 0,2 micron filtri a basso contenuto proteico vincolanti in 50 ml provette. Conservare nella -20 ° C freezer chiaramente etichettato con la data di raccolta senza fine e la data di HES collezione. Dopo 21 giorni di raccolta HES della cultura, eliminare i vermi. Pool 500-1000 ml di HES surnatante (di solito a magazzino congelato, e non, tra cui la collezione prima 24 ore) e concentrarsi su un filtro di 3.000 MWCO nel dispositivo di ultrafiltrazione in pressione di azoto. NOTA: Fare molta attenzione a non far funzionare il filtro a secco. Per impostare il dispositivo di filtro, prima lavare la parte lucida 3 kDa membrana verso il basso in un bicchiere 1 litro con acqua distillata per 3 x 20 min sotto agitazione. Montare il dispositivo di ultrafiltrazione secondo le istruzioni del produttore con membrana del filtro lato lucido in alto. Mettere in cabinet a 4 ° C e passare 50 ml di acqua distillata attraverso prima di iniziare a concentrarsi HES pool. Aggiungere ciascun tubo di HES nel dispositivo di filtrazione come richiesto (100-140 ml al giorno), fino a quando il volume viene concentrata fino a 2-5 ml. Al fine di rimuovere i contaminanti dal supporto di coltura HES contenenti, aggiungere 50 ml di pyrOgen-libera PBS al dispositivo di filtraggio e poi concentrarsi fino a circa 2 ml. Ripetere questa operazione per due volte (150 ml di PBS in totale). Trasferire HES in una provetta da 15 ml, sterilizzare il filtro (con un filtro da 0,2 micron) in una cappa a flusso laminare e misurare la concentrazione di proteine ​​utilizzando uno spettrofotometro (E 280 = 10) oppure mediante saggio Bradford. Aliquotare, etichetta con il numero di lotto e la data, e congelare a -80 ° C. Eseguire un test LAL cromogenico secondo protocolli del produttore di ciascun lotto di HES prima dell'uso. Se i livelli di LPS sono superiori a 1 U LPS per 1 mg di proteine, considerare non utilizzare questo batch per esperimenti in vivo o in colture in vitro. Trattare i HES raccolti a 24 ore separatamente nello stesso modo; esso conterrà LPS e alcune proteine ​​di accoglienza e, pur non adatto per esperimenti funzionali, è un'utile fonte di singole molecole che possono essere isolati dal monoclonale purificazione dell'anticorpo affinità. </ol>