La culture de<em> Heligmosomoides polygyrus:</em> Un immunomodulateur nématode parasite et de ses produits sécrétés

NOTE: Toutes les procédures dans ce protocole sont effectués conformément aux lignes directrices énoncées par le Royaume-Uni Home Office et de l'Université des Services vétérinaires Edimbourg. 1. L'infection de souris par gavage Magasin Heligmosomoides polygyrus L3 larves dans l'eau distillée jusqu'à six mois à 4 ° C. Avant utilisation, lavez larves L3 trois fois dans l'eau distillée: centrifuger à 300 g pendant 10 min (avec frein), mais enlever tous les 500 pi d'eau (pour éviter les larves L3 granulés inquiétante) et remettre le culot à chaque fois. Pour le troisième lavage, ajouter de l'eau à un volume exact (typiquement 40 ml) et aspirer 20 pi avec une pointe coupe 200 pi d'élargir son ouverture. Placer deux échantillons de 20 ul sur la surface d'une boîte de culture de 60 mm et compter les larves L3 (généralement mobile, et mieux vu sous un grossissement de 50X avec un microscope à dissection). Remettre en suspension le culot final dans de l'eau distillée à une Concentration de 2000 larves L3 par ml. Pour la production du cycle de vie, d'infecter (C57BL / 6xCBA) souris F1 huit semaines, âgé de 400 H. polygyrus larves L3 dans 200 ul d'eau distillée par gavage par voie orale (souris retenir en position verticale par la peau du cou et passer doucement l'aiguille de gavage émoussée par la bouche et de l'œsophage dans l'estomac). Bien agiter avant chaque infection (larves se installent rapidement dans l'eau) et aspirer 200 pi dans une seringue de 1 ml; utiliser une aiguille de gavage dédiée à bout arrondi. Pour l'infection expérimentale de souris plus jeunes (6-8 semaines anciens), ou d'autres souches consanguines (par exemple C57BL / 6 ou BALBc), infecter des souris avec 200 larves L3. 2. Propagation et entretien de H. polygyrus Placez charbon dans le centre d'une grande baignoire en plastique et laissez l'eau froide du robinet afin de fonctionner au-dessus d'un minimum de 30 min (non lavés charbon actif est toxique pour les larves L3). Videz l'eau de la baignoire et placer le charbon de bois sur tDeux couches de papier absorbant, le laissant exposé à l'air ambiant jusqu'à séchage complet. Si les œufs sont nécessaires, gratter les matières fécales premier sur le côlon avec des pinces et ciseaux (si nécessaire). Si un grand nombre de larves L3 est nécessaire, placer des souris sur une grille de fils et de recueillir des boulettes fécales sur plusieurs jours. Mélanger les selles avec du charbon de bois granulé à un rapport d'au moins 1: 1, pour obtenir une consistance juste humides assez pour adhérer à papier filtre. Appliquer une fine couche sur le centre de certains papier filtre humide dans une boîte de Pétri et placer dans une boîte humide (ajouter un peu de serviette de papier humide et un plat d'eau) dans l'obscurité pendant 12 à 14 jours. Retirer larves L3 de 7 jours à compter, et les recueillir sur au moins deux reprises avant que le papier est jeté. Les larves former un anneau autour du bord du papier filtre; soulever le papier filtre sur la boîte de Pétri et rincer les larves qui sont à gauche de la plaque (en utilisant une pipette et 5 ml d'eau stérile par plaque) dans un tube de 50 ml. Ascenseurle papier filtre et récolter les larves restant à gauche sur la plaque avec de l'eau distillée dans un tube de 50 ml. Centrifuger la solution d'effluents à 300 g pendant 10 min. Laver les larves trois fois à l'eau distillée, puis stocker à 4 ° C dans un maximum de 50 ml d'eau distillée jusqu'au moment requis. REMARQUE: Les larves restent viables et infectieux pendant au moins six mois. 3. Collection des adultes H. polygyrus Worms Préparer l'appareil Baermann modifié à l'avance comme représenté sur la Figure 1. Souris Cull quatorze jours après l'infection. Laver l'abdomen avec 70% d'éthanol. Couper la peau sur l'abdomen et tirez pour révéler la paroi abdominale antérieure. Faire une incision médiane pour entrer dans la cavité péritonéale. Retirer l'ensemble du petit et grand intestin (du duodénum proximal rectum distal). Placer dans une boîte de Pétri sec. Redresser l'intestin sur toute sa longueur; exciser le côlon fèces contenant; placer cela dans un plat à part pour les préparations d'œufs plus tard. Exciser les proximales 20 cm de l'intestin grêle qui contient les vers adultes -identified par la paroi relativement épaisse du duodénum et souvent un aspect rouge dues à des vers intra-luminal. Placez dans un (100 mm de diamètre) boîte de Pétri avec 5 ml de la solution de Hanks, chauffée à 37 ° C (deux spécimens par boîte). Ouvrez la partie de l'intestin proximal ver rempli longitudinalement avec des ciseaux (ciseaux à bout rond sont les meilleurs pour cela), et racler l'intérieur de paroi intestinale avec deux lames de verre pour enlever les vers. Puis jetez la paroi intestinale propre. Vers pointe dans de petits sacs de mousseline, base fermée et sécurisée avec trombones autour du bord de l'entonnoir de verre (Figure 1). Remplissez entonnoir avec une solution de Hanks et ajouter environ 4 boîtes de Pétri de vers dans chaque entonnoir. Placez l'appareil sur 37 ° C incubateur pendant 1-2 heures, en agitant doucement à mi-parcours pour délogerles débris de la préparation de l'intestin qui peuvent obstruer le filtre de mousseline. Prenez soin d'éviter le déversement de débris à l'extérieur du sac de mousseline – cela va causer une contamination de la préparation finale HES. Les vers adultes auraient lentement migré à travers le tissu de mousseline et se sont installés au fond du tube à essai en verre. Détacher délicatement le tube à essai dans le tuyau en caoutchouc reliant dessus de l'évier (en prenant soin d'éviter de perdre des vers à ce point). En utilisant une pipette en plastique, transférer les vers dans un tube de 50 ml et laver six fois avec Hanks Solution (permettent de vers à régler avec gravité, supprimer les médias avec un Stripette, ajouter 40 ml de Hanks Solution et répéter cinq fois). REMARQUE: la culture du ver doit être maintenue stérile partir de ce point. Déplacer vers une hotte à flux laminaire et laver encore six fois dans une solution stérile de Hanks additionné de 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, prêt pour la culture in vitro. Comptez levers adultes récupérés en prenant deux échantillons de 20 ul prises avec une pointe jaune coupe d'élargir son ouverture; attendre environ 50% de la quantité de larves inoculées. 4. Configuration de cultures pour HES: Préparation Moyen, adultes Worms Tremper les vers de 3,11 à environ 10 ml de RPMI additionné de 10% de gentamycine pendant 20 min, en laissant reposer le tube à un angle pour assurer des vers sont entièrement couverts. Effectuer cette dans une hotte à flux laminaire: laver à nouveau six fois avec une solution de Hanks (complété avec 5 U / ml de pénicilline et 5 ug / ml de streptomycine). Préparer H. polygrus médias. Le maintien de la stérilité dans une hotte à flux laminaire, à 500 ml de RPMI1640, ajouter 11,1 ml de 45% de glucose (concentration finale de 1,2% comme RPMI 1640 contenant 0,2% de glucose), 5 ml de 100x Peniclllin-streptomycine (concentration finale de 5 U / ml de pénicilline, 5 ug / ml de streptomycine), 5 ml de L-glutamine (2 mM de concentration finale), et5 ml de gentamycine (concentration finale 1%). Ne pas ajouter de FCS. vers aliquotes dans des flacons T25 ventilés, env. 1000 vers dans 15 ml H. polygyrus médias par flacon, et le lieu debout dans 37 ° C incubateur (5% de CO 2) pour trois semaines. 5. Préparation de HES Récupérer HES-contenant des milieux de culture à partir de cultures à des intervalles de plus de deux fois par semaine, l'annulation de la première collection après 24 h de la culture (en raison de niveaux élevés de contamination LPS et protéines de l'hôte – peuvent être traitées séparément ou mis au rebut). Gardez chaque collecte séparée et clairement étiquetés avec le numéro de date et lot. Remplacer avec un volume égal de H. polygyrus médias à chaque fois. Centrifugeuse HES-contenant les médias à 400 x g pendant 5 min. Puis filtrer stériliser par 0,2 um filtres à faible liaison aux protéines en tubes de 50 ml. Magasin dans le congélateur à -20 ° C clairement étiqueté avec la date de la récolte du ver et la date de HES collection. Après 21 jours de collecte HES de la culture, jeter vers. Piscine 500-1000 ml de surnageant HES (habituellement de stock congelé, et non y compris la collecte premières 24 h) et se concentrer sur un filtre de 3000 MWCO dans le dispositif d'ultrafiltration sous pression d'azote. NOTE: Soyez très prudent de ne pas laisser le filtre à sec. Pour mettre en place le dispositif de filtrage, d'abord laver le côté brillant de la membrane 3 kDa dans un bécher de 1 litre avec de l'eau distillée pendant 3 x 20 min tout en remuant. Monter le dispositif d'ultrafiltration selon les instructions du fabricant avec membrane filtrante côté brillant vers le haut. Lieu dans l'armoire à 4 ° C et passer 50 ml d'eau distillée à travers avant de commencer à se concentrer HES en gestion commune. Ajouter dans chaque tube de HES dans le dispositif de filtration selon les besoins (100 à 140 ml par jour), jusqu'à ce que le volume est concentré jusqu'à 2-5 ml. Afin d'éliminer les contaminants de milieux de culture contenant HES, ajouter 50 ml de pyrfibrinogène exempt de PBS au dispositif de filtration et vers le bas et ensuite concentré à environ 2 ml. Répétez cette étape deux fois (150 ml de PBS au total). Transfert HES dans un tube de 15 ml, stériliser par filtration (avec un filtre de 0,2 um) dans une hotte à flux laminaire et mesurer la concentration de protéine en utilisant un spectrophotomètre (E = 10 280) ou par dosage de Bradford. Aliquote, étiquette avec numéro de lot et la date, et le gel à -80 ° C. Effectuez un test de LAL chromogène selon les protocoles du fabricant sur chaque lot de HES avant de l'utiliser. Si les niveaux de LPS sont supérieures à 1 U LPS pour 1 pg de protéine, envisager de ne pas utiliser ce lot pour des expériences in vivo ou in vitro de cultures. Traiter les HES recueillies à 24 h séparément de la même manière; elle contient le LPS et des protéines de l'hôte et, tout en ne convient pas pour des expériences fonctionnelles, il est une source utile de molécules individuelles qui peuvent être isolés par monoclonal purification par affinité d'anticorps. </ol>