Неинвазивная оценка эффективности новых терапевтических средств для кишечника патологий помощи последовательной Эндоскопическая визуализации Живая мышей
概要
We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Abstract
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
Introduction
Колоректальный рак (CRC) является 4-й наиболее частой причиной злокачественных опухолей во всем мире 1. Несмотря на значительный прогресс в нашем понимании семейной основе этого заболевания, генетическая предрасположенность только способствует ~ 20% от CRC случаях 2. Остальные относятся к многочисленным внешних и экологических факторов, в том числе хронического воспаления. У людей, связь между хроническим воспалением и раком толстой кишки проявляется в язвенном колите (UC) пациентов, которые имеют более высокий риск развития колит, ассоциированных рак толстой кишки (CAC), в зависимости от продолжительности, степени и тяжести воспалительного заболевания 3 -5. Соответственно, новые методы лечения находятся в стадии разработки, чтобы контролировать иммунный ответ и соответствующую продукцию факторы роста воспалительными микросреды опухоли 6-8. Существует растущая потребность в соответствующих доклинических моделей животных охарактеризовать терапевтическую эффективностьэти препараты против развития и прогрессирования заболевания.
Мышиные модели однозначно показали, что воспалительное микроокружение вносит вклад в прогрессирование CRC, даже в отсутствие явной воспаления 9,10. Эти модели включают в себя использование сульфата полисахарида декстрана натрия (DSS), представленную в питьевой воде мышей, чтобы моделировать повреждения эпителия и острый и хронический Воспалительные заболевания кишечника (IBD) 11,12. Хотя механизм, с помощью которого DSS вызывает повреждение слизистой оболочки и колит полностью не поняты, некоторые исследования показывают, что DSS ингибирует клеточные обратной транскриптазы и рибонуклеазы деятельности внутри клеток, или способствует образованию нано-липидных комплексов, которые сливаются с толстой мембраной приводит к повреждение эпителия 13,14. Изменения в стандартной модели DSS также оказали значительную понимание механизмов, посредством которых толстой эпителиальные клетки сохраняют гомеостаза тканей и REGUпоздно слизистой иммунной реакции 15.
Внутрибрюшинное введение Azoxymethane (АОМ) в одиночку или в сочетании с DSS, обеспечивает модель для изучения взаимосвязи между соматических мутаций в эпителиальной слизистой и воспалительного и стромального микроокружения 16,17. АОМ метаболит канцероген 1,2-диметилгидразином (ДМГ), что непосредственно не приводит к мутациям ДНК. Вместо этого, АОМ гидролизуют с methylazoxymethanol (МАМ) по изоформы цитохрома CYP2E1 в печень, где МАМ, конъюгированного с глюкуроновой кислотой, а затем транспортируется в кишечник через желчные секреции 18. Считается, что бактериальная β-глюкуронидазы способствует деградации МАМ в результате алкилирования ДНК и к накоплению мутаций в эпителиальных клетках 19. Большинство АОМ, вызванных толстой опухоли укрывает миссенс мутации в гене, кодирующем β-катенина, что делает белок устойчив к протеасом degradatiна, что приводит к аберрантной активации канонического Wnt-сигнального пути 20. Когда деятельность ОСО сочетается с повреждением слизистой оболочки, вызванной DSS, последующее заживление ран ответ создает микросреду, которая способствует росту и расширению мутагенизированным эпителия. В одном из вариантов этой модели, повторяющиеся введение ОСО одна в течение нескольких недель могут быть использованы для моделирования спорадический рак толстой кишки, в отсутствие DSS-индуцированной колит 10,17. Эти два бесплатные модели обеспечивают экспериментальные установки для изучения САС и спорадические CRC соответственно, оба из которых связаны с про-воспалительных опухолевого микроокружения 10.
Использование последовательной эндоскопии у мышей был впервые Becker и коллеги 21, и обеспечивает продольную мониторинг колит и опухолевой прогрессии. Здесь мы предлагаем три доклинические протоколы на основе DSS-индуцированной повреждение слизистой оболочки и / или ОСО-опосредованной ТуМор индукции воспроизводимо вызывают определенные толстой патологии. Первый протокол описывает индукции острого повреждения слизистой оболочки в ответ на введение DSS, чтобы вызывать многие из гистопатологических признаков, связанных с IBD. Второй протокол основан на трех последовательных циклов управления DSS, чтобы имитировать вспышки воспаления, обычно наблюдаемой у пациентов с IBD, и может быть осуществлена в сочетании с АОМ-индуцированных мутаций. Итоговый протокол основан на АОМ-индуцированной спорадических эпителиальных мутаций. Для каждого из этих протоколов, мы расширяем на соответствующих стандартных процедур включает профилактические и терапевтические методы вмешательства, которые мы разработали для мониторинга эффективности новых лекарственных препаратов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Три протокола, которые описаны методы контурных надежной и воспроизводимой индукции толстой патологии болезни у мышей. В сочетании с обычной эндоскопической мониторинга и стратегий вмешательства, изложенных здесь, эти протоколы будут предоставлять мощный доклинические понимание эффективности терапии. Наши лаборатории обычно используют все из этих протоколов для мониторинга успех новой терапии 10,23,24.
Есть ряд соображений, при выборе доклинические животную модель для тестирования новых терапевтических. Они включают в себя актуальность модели на болезни человека, и вклад микроокружения опухоли к предлагаемым мерам терапевтической мишени. Здесь мы предлагаем три протокола для терапевтического вмешательства в установленных моделей кишечных заболеваний. Эти модели являются воспроизводимыми и доставка реагентов, чтобы вызвать заболевание легко управлять. Важно отметить, что модели очень актуальныв различных аспектах и этапах колит начала и инициации и прогрессии опухоли. Исследователи должны учитывать генетический фон штаммов мыши, используемых при проектировании экспериментов, так как восприимчивость к болезни, вызванной DSS и / или ОСО может значительно +25 меняться. Кроме того, различные микробные сообщества могут иметь различные возможности обмена в контексте ОСО, которые метаболизируются бактерий. Мы предупреждаем против использования различных когорт мышей, которые родились в разных учреждениях животных (в том числе коммерческих поставщиков) в одном эксперименте. Точно так же, отличается микрофлора у мышей используются из различных средств может вызвать различные ответы хозяева расписок, вызванных повреждение эпителия барьера 11. Кроме того, соответствующая анализ ткани (например, для очистки РНК) также должны быть рассмотрены, поскольку способность DSS, чтобы ингибировать обратную транскриптазу повлияет на последующее молекулярного анализа 26,27.
<p claсс = "jove_content"> Мышь эндоскопия техника передний край неоднократно наблюдать начало заболевания и прогрессирования в отдельной мыши. Возможность записи видео и извлекать неподвижные изображения позволяет легко мониторинг нескольких параметров заболеваний и опухолей. В дополнение к улучшению благосостояния животных, эндоскопическая мониторинга также уменьшает потребность в многочисленных когорт подопытных мышей, которые традиционно были отобраны на разных временных точках, чтобы отслеживать исход заболевания. Система подсчета очков MEICS не является заменой для гистопатологического анализа, но и обеспечивает альтернативные средства для контроля здоровья животных и повреждение слизистой оболочки в живых мышей. Мышь эндоскопия специализированная техника лаборатория, и все процедуры должны выполняться квалифицированным персоналом для обеспечения надлежащего обработке и обращении мышей, а также для обеспечения стабильного качества в изображениях, используемых для озвучивания заболевания. В руках квалифицированных кадров, мы обнаружили, что эндоскопия вызывает мало или никакого повреждения тумоRS, которые могут привести внутри опухолевой кровотечение. Для терапевтических протоколов, описанных, мы считаем, эндоскопия очень выгодно, так как он дает возможность определить начальную опухолевой, и позволяет нам группы когорт животных с похожими трудностями опухолевых до введения терапевтического препарата. Последовательное мониторирование мышей позволяет ученым определить эффективность новых методов лечения на ранней стадии, с возможностью прекращения неудачных экспериментов своевременно.Как нашем понимании воспалительного заболевания кишечника и колоректального рака заранее, будут определены новые цели для терапии. Соответствующие модели на животных будут являться неотъемлемой частью обеспечения, что наиболее перспективными новые методы лечения движутся навстречу клинических испытаний.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
| Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
| Vanilla Protein Shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
| Isoflourane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
| Coloview miniendoscopic system | |||
| Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
| Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
| HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
| Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
| Fubre Optic Light Cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
| Computer and media player software | MAC, imovies | ||
| Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |
参考文献
- Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
- Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
- Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
- Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
- Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
- Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
- Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
- Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
- Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
- Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Rose, W. A., Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41 (2012).
- Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084 (2012).
- Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
- Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
- Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
- Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
- Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
- Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
- Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
- Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350 (2013).
- Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).
