Évaluation non invasive de l'efficacité de nouveaux traitements pour les pathologies intestinales en utilisant l'imagerie endoscopique de série de souris vivantes

L'Institut Walter et Eliza Hall of Medical Research comité d'éthique des animaux a approuvé chacune des procédures décrites dans ces protocoles. 1. Préparation des souris expérimentales Composez cohortes expérimentales d'au moins 4 semaines entre les sexes appariés 6-8 vieilles souris C57BL / 6 (M. musculus) qui sont élevés et logés dans le même agent pathogène spécifique (SPF) animalerie / chambre et fournis avec de la nourriture et de l'eau autoclave. L'utilisation de souris femelles permettra co-logement de souris à partir de différentes lignes, numéros de case limite, et réduire la variation cage à cage. Veiller à ce que les souris sont au moins 6 semaines d'âge pour permettre des procédures d'endoscopie utilisant la gaine diamètre de 3,0 mm endoscopie. Utilisation des souris de la même origine génétique et, si possible, de cages stockés sur le même rack pour réduire les variations associées à la microflore intestinale. Variations de la microflore entre les installations d'animaux devraient être prises en considération when déterminer les souris et les génotypes de contrôle appropriées pour chaque expérience 22. Mark souris par des coupures oreille / d'orteil, tatouages, ou similaires pour permettre une identification facile. Peser souris au jour 0, pour déterminer les poids de référence expérimentaux. Effectuer endoscopie (voir la section 5) de souris au jour 0 pour enregistrer phénotypes coliques base. 2. instance pré-clinique dans une altération de l'épithélium et la colite aiguë Modèle Préparer une solution de l'agent thérapeutique à tester. Pour thérapeutiques délivrés par gavage oral (po), préparer des solutions à un volume maximal de 100 ul. Pour thérapeutiques délivrés par voie intrapéritonéale (ip) injection, préparer des solutions à un volume maximal de 200 ul. REMARQUE: répétée ip ou po administration du médicament sur des périodes de temps prolongées peut entraîner un comportement de la souris modifiée. Alternez le site d'injection ip pour éviter le malaise prolongée. Pour l'administration orale, fournir les souris avec Autocbaigné graines de tournesol en tant que «traiter» pour minimiser l'association indésirable avec la procédure de gavage. Le Jour 1, administrer le thérapeutique d'intérêt (préparé à l'étape 2.1) et les contrôles de véhicules appropriés. Dans l'exemple fourni (figure 6A), 5 ug de recombinant humain (rh) iInterleukin (IL) -11 protéine a été dissous dans 200 ul de tampon phosphate salin (PBS) et administré ip Déterminer le moment et la fréquence des administrations, qui sera dépendant du profil pharmacocinétique établi pour le réactif thérapeutique qui est testée. Figure 1 illustre un traitement prophylactique en utilisant des injections deux fois par jour ip au cours de l'expérience. Surveiller, notamment la consistance des selles et la présence de sang, et peser chaque souris quotidienne. Sur les jours de traitement, d'un poids devrait coïncider avec l'administration du médicament thérapeutique pour minimiser le stress aux souris provoquées par des manipulations répétées. </li> Le jour 3, préparer 2,5% (2,5 g / 100 ml) de solution DSS dans l'eau de boisson fournie régulièrement à la souris par l'animalerie. Environ 5 ml / souris / jour de solution DSS est requis pour l'expérience. La consommation de l'eau DSS peut changer si la température ambiante de l'animalerie fluctue. REMARQUE: DSS est un irritant et doit être manipulé conformément aux instructions des fiches signalétiques. Fournir DSS frais aux souris ad libitum dans des bouteilles d'eau potable pour cinq jours consécutifs. Dans la soirée du Jour 5, fournir de l'eau potable normale, en plus de boulettes de nourriture en purée et un supplément de protéines fournie dans les petites boîtes de Pétri (100 g granulés alimentaires / 10 g de protéines de bougé / 10 ml d'eau). Cela empêche la déshydratation et aide à réduire au minimum la perte de poids sévère. Euthanasier les souris par l'intoxication CO 2 et de recueillir des tissus pour l'analyse histologique ultérieure le matin du Jour 8, ou lorsque les souris vivent ≥15% de perte de poids de plus de trois consecutive jours, selon la première éventualité. REMARQUE: Réglez la dose DSS entre 1-4% (p / v) en fonction de la microflore de l'animalerie et le lot de DSS. Effectuer, les tests de routine des lots pour établir la dose appropriée de DSS et la variation contourner lot à lot. Le dosage approprié doit être basée sur la perte de poids (pas plus de 15% du poids initial) et confirmé la colite histopathologie. 3. instance pré-clinique dans une colite chronique ou modèle de cancer colite associée Pour le modèle de colite chronique commencer à l'étape 3.7. Pour le modèle cancer de la colite associée (CAC), le Jour 1, injecter chaque souris avec 10 mg / kg (p / p) azoxyméthane (AOM, 250 pi, ip). REMARQUE: AOM est un cancérogène et doit être manipulé conformément aux instructions des fiches signalétiques. Les solutions mères d'OMA sont préparés comme 10 mg / ml aliquotes et stockés à -20 ° C. Le jour de l'injection, la solution mère de l'OMA est décongelé et dilué à 1 mg / ml dans du PBS. Congélation et la décongélation de la solution mère AOM répétée doivent être évités. La dose peut être ajustée AOM entre 8-12 mg / kg. Les tests de routine des lots est nécessaire pour établir la dose appropriée AOM afin de contourner la toxicité à des souris dues aux variations de lot à lot. Lors des Journées 1-7 suivants poids de l'administration de l'OMA seront stables et pour cette raison la surveillance de poids peut être omis lors des Journées 1-7 pour éviter la manutention des animaux qui excréter métabolites cytotoxiques dans leurs excréments. Le jour 7 toute la literie doit être changée suivant les procédures cytotoxiques. Une fois le changement de literie est complète, les animaux ne ont plus besoin des procédures de manipulation cytotoxiques, car ils ne seront plus excréter métabolites cytotoxiques. Au jour 8, préparer 2,5% (2,5 g / 100 ml) solution DSS (comme décrit à l'étape 2.5) et fournir à la souris ad libitum. Peser souris quotidiennement tout au long de l'expérience et de surveiller les signes de la maladie, y compris fu volantsr, se courber, selles sanglantes et le mouvement réduite. Le Jour 13, retirez la solution DSS et fournir les souris avec de l'eau potable normale jusqu'au jour 28. Jours 8-28 constituent l'un «cycle» du protocole colite / CAC chronique. Les jours de 13 à 28, lorsque les souris reçoivent de l'eau potable normale, fournir les souris avec des boulettes de nourriture en purée et un supplément de protéines fournie dans les petites boîtes de Pétri (100 g boulettes de nourriture / 10 g Protein Shake / 10 ml d'eau). Cela empêche la déshydratation et aide à réduire au minimum la perte de poids sévère. REMARQUE: Les suppléments de protéines dans la purée ne doivent pas être fournis lorsque les souris reçoivent DSS-contenant de l'eau potable afin d'assurer la cohérence de la consommation DSS. Le Jour 20 effectuer le second examen endoscopique pour surveiller la santé individuelle de la souris (voir la section 5). Le jour 29 répéter le cycle DSS (Cycle 2: 2,5% (p / v) du SSD lors des Journées 29-33 et de l'eau potable normale lors des Journées 34-50). Le jour 40 effectuer la third examen endoscopique pour surveiller la santé individuelle de la souris et de déterminer la charge tumorale (voir la section 5). Si aucune tumeurs sont visibles par endoscopie le jour 40, commencer un troisième cycle de DSS Days 50-72 (Cycle 3: 2,5% (p / v) du SSD lors des Journées 50-55 et de l'eau potable normale lors des Journées 56-72). En général, les tumeurs peuvent être consultées par jour 40 et par conséquent le troisième cycle de DSS peut être omis. Une fois les tumeurs deviennent visibles par l'examen endoscopique, attribuer à chaque souris un score endoscopique de la tumeur (voir la section 5) et attribuer souris individuelles à des cohortes avec charges similaires tumorales base. Le jour 42 (ou lorsque les tumeurs sont visibles), administrer le composé thérapeutique ou le contrôle du véhicule concerné (voir section 2.2). Le calendrier des doses dépendra le profil pharmacocinétique de l'agent thérapeutique. Un exemple d'un traitement d'intervention injecté ip trois fois par semaine chez des souris avec des tumeurs établies est prévu (figure 2). Effectuer eexamens ndoscopic une fois par semaine pendant la durée du traitement thérapeutique pour surveiller la charge tumorale. Généralement, quatre semaines d'un traitement thérapeutique est suffisante pour observer une réponse au traitement objectif. Après l'arrêt du traitement, une cohorte de souris peut également être contrôlé par endoscopie de rechute de la tumeur. Euthanasier les souris par l'intoxication CO 2 et de recueillir des tissus pour l'analyse biochimique et / ou histologique le matin du jour 72 ou lorsque les souris vivent ≥15% de perte de poids de plus de trois jours consécutifs, selon la première éventualité. 4. instance pré-clinique dans un cancer colorectal sporadique Modèle Le Jour 1, injecter chaque ip de la souris avec 10 mg / kg AOM (voir l'étape 3.2). La dose peut être ajustée AOM entre 8-12 mg / kg. Les tests de routine des lots est nécessaire pour établir la dose appropriée AOM afin de contourner la toxicité à des souris dues aux variations de lot à lot. Répéter l'injection, le premier jour de chaque semainepour les cinq semaines suivantes (figure 3). Les souris doivent être traités conformément à des procédures de sécurité cytotoxique pour l'ensemble des 6 semaines. Peser chaque souris sur le jour de l'injection d'AOM minimiser la détresse des souris provoquées par des manipulations répétées. REMARQUE: AOM est un cancérogène et doit être manipulé conformément aux instructions des fiches signalétiques. Tous les animaux doivent être traités conformément aux procédures de sécurité cytotoxiques pour les six semaines de AOM injections ip requises pour ce protocole. Pendant huit semaines effectuer un examen endoscopique pour surveiller les tumeurs émergents (voir la section 5). L'examen endoscopique doit être effectuée toutes les deux semaines jusqu'à ce que les tumeurs deviennent visibles. Généralement, de type sauvage C57BL / 6 animaux commencent à développer des tumeurs d'environ 40 semaines après l'administration initiale de l'OMA. Une fois les tumeurs deviennent visibles par l'examen endoscopique, assigner chaque souris un score endoscopique de la tumeur (voir la section 5) et attribuer souris individuelles à une cohorte similaire charges tumorales avant le début du traitement thérapeutique. Cours de la semaine 40 (ou lorsque les tumeurs sont d'abord visibles), administrer le composé thérapeutique ou le contrôle du véhicule concerné. Le calendrier des doses dépendra le profil pharmacocinétique de l'agent thérapeutique (voir étape 2.1). Un exemple d'un traitement d'intervention injecté ip 3 fois par semaine chez des souris avec des tumeurs établies est prévu (figure 3). Effectuer hebdomadaire d'examen endoscopique de la durée des périodes de traitement thérapeutique pour contrôler la charge tumorale. Généralement, quatre semaines d'un traitement thérapeutique est suffisante pour une réponse au traitement objectif. Après l'arrêt du traitement, une cohorte de souris peut également être contrôlé par endoscopie de rechute de la tumeur. Euthanasier les souris par l'intoxication CO 2 et de recueillir des tissus pour l'analyse biochimique et / ou histologique du colon et de tumeurs au cours de la semaine 45, ou après 4 semaines de traitement. ve_title "> 5. Les examens endoscopiques Le matériel d'endoscopie doit être assemblé selon des procédures standard 16. Stériliser et nettoyer la sonde de l'endoscope avec 70% d'éthanol ou un lubrifiant anti-bactérienne. Les vidéos peuvent être enregistrées en utilisant un ordinateur portable ou de bureau et des logiciels de support standard, comme iMovie. Un moniteur d'ordinateur standard, plutôt que d'un moniteur de qualité médicale, est suffisante pour visualiser le côlon au cours de la procédure d'endoscopie (figure 4). Anesthésier des groupes de 5-6 souris simultanément dans une chambre avec 3% d'isoflurane dans 100% de O 2 à un débit de 0,2 à 0,4 L / min. Une fois que la souris sont anesthésiés, ce qui est confirmé par pincement de l'orteil; les niveaux de l'isoflurane devraient être modifiés pour 0,5 à 2% pour l'entretien. Supprimer une souris individuelle de la chambre, et le placer face ventrale avec sa tête fixée dans un embout conique. Anesthésie complets doivent être surveillés et les pattes de derrière doivent être ajustés de sorte qu'ils sont stretched derrière la souris. Placez une pommade vétérinaire sur les yeux des souris pour prévenir la sécheresse. Maintenir la queue de la souris où il rencontre la colonne vertébrale inférieure de révéler clairement l'anus. Insérer la gaine de l'endoscope rigide dans un bécher d'eau et ajuster le débit d'air pour permettre la libération d'une petite bulle à la fois. Le flux d'air permettra de gonfler le côlon. Si le flux d'air est trop fort, l'air est pompé dans l'estomac de la souris. Aucune lubrification supplémentaire ne est nécessaire. Insérez délicatement la gaine de l'endoscope rigide dans le rectum. Généralement, l'endoscope peut être inséré jusqu'à 3 cm, à quel point le côlon dans les courbes de souris et ne est pas accessible à l'endoscope rigide. Une difficulté commune au cours des procédures d'endoscopie est le blocage de l'accès à la lumière du côlon du fait de la matière fécale. Évitez cela en massant doucement du ventre des souris avant la procédure d'encourager la défécation ou attentivement la manœuvre de l'endoscope dans le fecal question au cours de la procédure. Péristaltisme peut également se produire, au cours de laquelle l'endoscope doit être maintenu en position jusqu'à ce que la musculature du côlon détend. Lancer l'enregistrement vidéo à ne importe quel stade de la procédure d'endoscopie. Maladie notation peut être enregistrée par un assistant expérimenté lors de la procédure, ou à un moment ultérieur à partir des fichiers vidéo. Suite à l'examen endoscopique, retourner les souris de leur cage et les surveiller lors de la récupération de l'anesthésie. Les animaux sont généralement éveillé et mobile à l'intérieur 2 min après le retrait de l'isoflurane administration cône de nez. Veiller à ce que ces procédures sont effectuées par un scientifique expérimenté. Chaque procédure d'endoscopie prendra environ 2 min par souris. 6. Maladie de notation Pour surveiller la colite, marquer vidéos pour l'indice murin endoscopique de sévérité de la colite (MEICS) 16, qui documente les changements dans (i) l'épaisseur de la paroi du côlon indiqué par la transparence, (Ii) la consistance des selles, (iii) l'intégrité du vaisseau sanguin et de la présence, (iv) les ulcères et les zones de régénération qui présentent de façon granulaire, (v) le saignement indiqués par des dépôts de fibrine (figure 5a). Pour surveiller la charge tumorale, marquer vidéos pour l'incidence des tumeurs et la taille. La taille des tumeurs est déterminée par le diamètre de la lumière colique occupées par la tumeur 16 (figure 5b). Il est courant d'utiliser les deux paramètres de colite et de notation de la tumeur pour une seule souris. Par endoscopie, tumeurs individuelles et la santé de la muqueuse du côlon peut être suivie dans le temps, offrant une lecture-out pour le succès de nouveaux traitements chez un seul animal. (Facultatif) Les images fixes peuvent être extraites des vidéos pour la génération de figures représentatives (figure 6).