JoVE Journal > Medicine
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Niet-invasieve evaluatie van de werkzaamheid van nieuwe therapieën voor Intestinale Pathologieën gebruik van een serieel Endoscopische Imaging van levende muizen

Published: March 10, 2015
doi:
10.3791/52383
, ,
1The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research, 2The Department of Medical Biology,University of Melbourne, 3Olivia Newton-John Cancer Research Institute

概要

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

Abstract

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

Introduction

Colorectale kanker (CRC) is de 4 e meest voorkomende oorzaak van maligniteit wereldwijd 1. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de familiale basis van deze ziekte, genetische aanleg alleen bijdraagt ​​tot ~ 20% van de gevallen CRC 2. Het resterende deel worden toegeschreven aan tal van extrinsieke factoren en omgevingsfactoren, met inbegrip van chronische ontsteking. Bij mensen is het verband tussen chronische ontsteking en darmkanker blijkt uit colitis ulcerosa (UC) patiënten die een groter risico-geassocieerde colitis colonkanker (CAC), afhankelijk van de duur, de omvang en ernst van de ontsteking 3 -5. Dienovereenkomstig nieuwe therapieën in ontwikkeling om de immuunrespons en de bijbehorende productie van groeibevorderende factoren die de inflammatoire tumor micro 6-8 beheersen. Er is een toenemende behoefte aan passende preklinische diermodellen om de therapeutische werkzaamheid van karakteriserendeze geneesmiddelen tegen de ontwikkeling en progressie van de ziekte.

Muismodellen ondubbelzinnig aangetoond dat de inflammatoire micro bijdraagt ​​tot CRC progressie, zelfs bij afwezigheid van duidelijke ontsteking 9,10. Deze modellen omvatten het gebruik van de polysaccharide dextransulfaatnatrium (DSS), die in het drinkwater van muizen, model epitheliale schade en acute en chronische inflammatoire darmziekte (IBD) 11,12. Hoewel het mechanisme waardoor DSS induceert mucosale beschadiging en colitis wordt niet volledig begrepen, sommige studies suggereren dat DSS remt cellulaire reverse transcriptase en ribonuclease-activiteiten in cellen of bevordert de vorming van nano-lipidecomplexen die fuseren met de colon membraan leidt tot beschadiging epitheliale 13,14. Wijzigingen aan de standaard DSS model hebben ook een significante inzicht in de mechanismen die colon epitheelcellen behouden weefselhomeostase en regulaat mucosale immuunrespons 15.

Intraperitoneale toediening van Azoxymethaan (AOM) alleen, of in combinatie met DSS, een model voor het onderzoeken van de interactie tussen somatische mutaties in de epitheliale mucosa en inflammatoire en stromale micro 16,17. AOM is een metaboliet van het carcinogeen 1,2-dimethylhydrazine (DMH) die niet direct resulteert in DNA-mutaties. In plaats daarvan AOM gehydrolyseerd methylazoxymethanol (MAM) van het cytochroom isovorm CYP2E1 in de lever, waar MAM geconjugeerd met glucuronzuur en vervolgens door gal afscheiding 18 naar de darm getransporteerd. Men denkt dat het bacteriële β-glucuronidase bijdraagt ​​tot de afbraak van MAM wat DNA-alkylering en de accumulatie van mutaties in epitheelcellen 19. Meest AOM geïnduceerde colontumoren haven missense mutaties in het gen dat codeert β-catenine, waardoor het eiwit resistent tegen proteasomale degradatiop, waardoor afwijkende activering van de Wnt-signaleringsroute 20. Wanneer de activiteit van AOM wordt gecombineerd met de mucosale schade veroorzaakt door DSS, de daaropvolgende wondgenezing respons een micro die bevorderlijk is voor de groei en uitbreiding van de gemutageniseerde epitheel. In een variatie van dit model kan herhaalde toediening van AOM alleen gedurende verscheidene weken worden gemodelleerd sporadische colorectale kanker, in afwezigheid van DSS-geïnduceerde colitis 10,17. Deze twee elkaar aanvullende modellen verschaffen experimentele instellingen CAC en colontumoren respectievelijk bestuderen, die beide zijn geassocieerd met een pro-inflammatoir tumor micro 10.

Het gebruik van seriële endoscopie bij muizen werd ontwikkeld door Becker en collega 21, en ​​maakt het longitudinaal volgen van colitis en tumorprogressie. Hier geven we drie pre-klinische protocollen op basis van DSS-geïnduceerde mucosale beschadiging en / of AOM gemedieerde tumor inductie reproduceerbaar te induceren specifieke colon pathologieën. Het eerste protocol beschrijft induceren acute mucosale beschadiging als reactie op DSS toediening aan veel van de histopathologische kenmerken geassocieerd met IBD opwekken. Het tweede protocol is gebaseerd op drie opeenvolgende cycli van DSS toediening aan de fakkels van de ontsteking vaak waargenomen bij IBD patiënten na te bootsen, en kan in combinatie worden uitgevoerd met-AOM geïnduceerde mutaties. Het uiteindelijke protocol is gebaseerd op-AOM geïnduceerde sporadische epitheliale mutaties. Voor elk van deze protocollen, we breiden de desbetreffende standaardprocedures voor profylactische en therapeutische interventie methoden die we hebben ontwikkeld om de effectiviteit van nieuwe geneesmiddelen monitoren omvatten.

Protocol

De Walter en Eliza Hall Institute of Medical Research dier ethische commissie goedgekeurd elk van de in deze protocollen beschreven procedures. 1. Voorbereiding van de Experimentele Muizen Componeren experimentele cohorten van tenminste 4 geslacht geëvenaard 6-8 weken oude C57BL / 6 muizen (M. musculus) die worden gefokt en gehuisvest in hetzelfde specifieke pathogenen (SPF) dier voorziening / kamer en voorzien van geautoclaveerd voedsel en water. Het gebruik van vrouwelijke muizen zal co-housing van muizen toelaten van verschillende lijnen, limiet doos nummers, en het verminderen van kooi-to-kooi variatie. Zorg ervoor dat muizen zijn minstens 6 weken oud zijn om endoscopie procedures met behulp van de 3,0 mm diameter endoscopie schede mogelijk te maken. Gebruik muizen van dezelfde genetische achtergrond, en, waar mogelijk, uit kooien opgeslagen op dezelfde rek voor variaties in verband met de darmflora te verminderen. Variaties in de microflora tussen dier faciliteiten moeten rekening whe worden genomenn het bepalen van de juiste controle muizen en genotypen voor elk experiment 22. Mark muizen op het gehoor / teen knipsels, tatoeages, of soortgelijke om gemakkelijk te kunnen identificeren. Weeg muizen op dag 0, de uitgangswaarde experimentele gewichten te bepalen. Voeren endoscopie (zie hoofdstuk 5) van de muizen op dag 0 tot basislijn colon fenotypes opnemen. 2. Pre-klinisch onderzoek bij een beschadiging van het epitheel en Acute Colitis Model Bereid een oplossing van het therapeutische middel te testen. Voor therapeutische door orale sondevoeding (po) geleverde oplossingen bereid om een ​​maximaal volume van 100 pl. Voor therapeutische door intraperitoneale (ip) injectie geleverde oplossingen bereid om een ​​maximaal volume van 200 ui. OPMERKING: Herhaalde ip of po toediening van het geneesmiddel gedurende langere tijd kan resulteren in veranderde muis gedrag. Wissel de ip injectieplaats om langdurig ongemak te voorkomen. Voor po administratie, bieden de muizen met autoclaved zonnebloempitten als een 'traktatie' om de negatieve associatie met de maagsonde procedure te minimaliseren. Op dag 1, beheren van de therapeutisch van belang (bereid in stap 2.1) en passende voertuig controles. In het voorbeeld (figuur 6A), 5 ug recombinant humaan (rh) iInterleukin (IL) -11 proteïne werd opgelost in 200 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en ip toegediend Bepaal de timing en frequentie van de toedieningen, die afhankelijk zijn van de farmacokinetische profiel vastgesteld voor de therapeutische reagens dat wordt getest wordt. Figuur 1 schetst profylactische behandeling met tweemaal daags ip injectie in de loop van het experiment. Controleren, met inbegrip van consistentie van de ontlasting en de aanwezigheid van bloed, en wegen elke muis dagelijks. Op de dagen behandeling weging moet samenvallen met toediening van het therapeutische geneesmiddel spanning aan de muizen veroorzaakt door herhaalde behandeling te minimaliseren. </li> Op dag 3, bereidt 2,5% (2,5 g / 100 ml) oplossing DSS in het drinkwater van de dieren faciliteit routinematig de muizen ontvangen. Ongeveer 5 ml / muis / dag van DSS oplossing is vereist voor het experiment. Het verbruik van de DSS water kunnen veranderen als de omgevingstemperatuur van het dier faciliteit fluctueert. OPMERKING: DSS is een irriterend en dienen in overeenstemming met de MSDS instructies worden behandeld. Zorg voor frisse DSS aan de muizen ad libitum in schoon water flessen voor 5 aaneengesloten dagen. Op de avond van Dag 5, bieden normale drinkwater naast gepureerd voedsel pellets en een eiwit supplement voorzien in kleine petrischalen (100 g voedsel pellets / 10 g eiwit shake / 10 ml water). Dit voorkomt uitdroging en helpt bij het minimaliseren van ernstig gewichtsverlies. Euthanaseren muizen door CO 2 intoxicatie en weefsels voor latere histologische analyse te verzamelen op de ochtend van dag 8, of wanneer de muizen ervaren ≥15% gewichtsverlies van meer dan drie consecutive dagen, indien dit eerder plaatsvindt. OPMERKING: Stel de DSS dosis tussen 1-4% (w / v) afhankelijk van de microflora van het dier faciliteit en de partij DSS. Voer routine batch testen om de juiste dosering DSS en omzeilen batch-to-batch variatie vast. De juiste dosering moet worden gebaseerd op gewicht-verlies (niet groter dan 15% van het oorspronkelijke gewicht) en bevestigd colitis histopathologie. 3. Pre-klinische Trial in een chronische colitis of colitis-geassocieerde Cancer Voor de chronische colitis model beginnen vanaf stap 3.7. Voor de colitis-geassocieerde kanker (CAC) model, op dag 1, elke muis geïnjecteerd met 10 mg / kg (w / w) Azoxymethaan (AOM, 250 pl, ip). OPMERKING: AOM is kankerverwekkend en moet in overeenstemming met de MSDS instructies worden behandeld. Voorraadoplossingen van AOM worden bereid als 10 mg / ml porties en bij -20 ° C. Op de dag van de injectie wordt de AOM stockoplossing ontdooid en verdund tot 1 mg / ml in PBS. Herhaald invriezen en ontdooien van de AOM voorraadoplossing worden vermeden. De AOM dosis kan worden aangepast tussen 8-12 mg / kg. Routine batch proeven moeten de juiste dosering vast AOM om toxiciteit omzeild muizen door batch-to-batch variatie. Tijdens dagen 1-7 na toediening AOM gewichten stabiel zijn en daarom het gewicht bewaking kan weggelaten tijdens Dagen 1-7 met dieren die cytotoxische metabolieten uitscheiden in hun ontlasting te voorkomen. Op dag 7 moet alle beddengoed worden veranderd na de cytotoxische procedures. Zodra het beddengoed verandering is voltooid, de dieren niet meer cytotoxische hanteren procedures vereisen, omdat ze niet meer uitscheiden cytotoxische metabolieten. Op dag 8 Bereid 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS oplossing (zoals beschreven in stap 2.5) en verstrekken de muizen ad libitum. Weeg muizen dagelijks gedurende het experiment en controleren op tekenen van ziekte, met inbegrip van gegolfde fur, hunching, bloederige ontlasting en verminderde beweeglijkheid. Op dag 13, verwijder de DSS-oplossing en zorgen voor de muizen met normale drinkwater tot Dag 28. Dagen 8-28 vormen een 'cyclus' van de chronische colitis / CAC-protocol. Op dag 13-28, wanneer de muizen krijgen normaal drinkwater, bieden de muizen met gepureerd voedsel pellets en een eiwit supplement voorzien in kleine petrischalen (100 g voedsel pellets / 10 g eiwit shake / 10 ml water). Dit voorkomt uitdroging en helpt bij het minimaliseren van ernstig gewichtsverlies. OPMERKING: De eiwitsupplementen in beslag mag niet worden verstrekt wanneer de muizen krijgen DSS-bevattend drinkwater om de consistentie in DSS verbruik te garanderen. Op dag 20 voeren de tweede endoscopisch onderzoek te bewaken individuele muis gezondheid (zie hoofdstuk 5). Op dag 29 herhaalt de DSS-cyclus (cyclus 2: 2,5% (w / v) DSS verstrekt tijdens Dagen 29-33 en de normale drinkwater tijdens Dagen 34-50). Op dag 40 voeren de third endoscopisch onderzoek te bewaken individuele muis gezondheid en bepalen tumorbelasting (zie hoofdstuk 5). Als er geen tumoren zijn zichtbaar door endoscopie op dag 40, begint een derde DSS-cyclus op dag 50-72 (cyclus 3: 2,5% (w / v) DSS verstrekt tijdens Dagen 50-55 en de normale drinkwater tijdens Dagen 56-72). Algemeen tumoren zichtbaar op dag 40 en dus de derde cyclus van DSS kan worden weggelaten. Zodra tumoren zichtbaar door endoscopisch onderzoek, wijzen elke muis een endoscopische tumor score (zie hoofdstuk 5) en wijs individuele muizen om cohorten met gelijkaardige basislijn tumor lasten. Op dag 42 (of wanneer tumoren zichtbaar zijn), beheren van de therapeutische verbinding of relevante controle over het voertuig (zie paragraaf 2.2). De tijdstippen van toediening zal afhankelijk zijn van de farmacokinetische profiel van het therapeutisch zijn. Een voorbeeld van een interventie behandeling ip geïnjecteerd drie maal per week in muizen met gevestigde tumoren is (figuur 2). Presteren endoscopic examens eenmaal per week gedurende de duur van het therapeutische behandeling te controleren tumorlast. Algemeen 4 weken een therapeutische behandeling voldoende om een ​​objectieve behandelingsrespons observeren. Na beëindiging van de behandeling, kan een cohort van muizen ook worden gecontroleerd door middel van endoscopie voor tumor recidief. Euthanaseren muizen door CO 2 intoxicatie en weefsels voor biochemische en / of histologische analyse te verzamelen op de ochtend van dag 72 of wanneer muizen ervaren ≥15% gewichtsverlies van meer dan drie opeenvolgende dagen, indien dit eerder plaatsvindt. 4. Pre-klinische Trial in een Sporadische Colorectal Cancer Op dag 1, injecteer elke muis ip met 10 mg / kg AOM (zie stap 3.2). De AOM dosis kan worden aangepast tussen 8-12 mg / kg. Routine batch proeven moeten de juiste dosering vast AOM om toxiciteit omzeild muizen door batch-to-batch variatie. Herhaal de injectie op de eerste dag van elke weekvoor de volgende 5 weken (figuur 3). De muizen moeten worden behandeld volgens de cytotoxische veiligheidsprocedures voor de gehele 6 weken. Weeg elke muis op de dag van AOM injectie om nood aan de muizen veroorzaakt door herhaalde behandeling te minimaliseren. OPMERKING: AOM is kankerverwekkend en moet in overeenstemming met de MSDS instructies worden behandeld. Alle dieren moeten worden behandeld volgens de cytotoxische veiligheidsprocedures voor de 6 weken van AOM ip-injecties nodig zijn voor dit protocol. In week 8 voeren endoscopisch onderzoek om te controleren op nieuwe tumoren (zie hoofdstuk 5). Endoscopisch onderzoek moet elke twee weken worden uitgevoerd tot tumoren zichtbaar worden. Algemeen wild-type C57BL / 6 dieren gaan tumoren ongeveer 40 weken ontwikkelen na de eerste toediening van AOM. Zodra tumoren zichtbaar door endoscopisch onderzoek, wijzen elke muis een endoscopische tumor score (zie hoofdstuk 5) en wijs individuele muizen om een ​​cohort met gelijkaardige tumor lasten voor de aanvang van de therapeutische behandeling. Tijdens week 40 (of wanneer tumoren zijn eerste zichtbare), beheren van de therapeutische verbinding of het desbetreffende voertuig controle. De tijdstippen van toediening zal afhankelijk zijn van het farmacokinetische profiel van de therapeutische (zie stap 2.1). Een voorbeeld van een interventie behandeling ip geïnjecteerd 3 maal per week in muizen met gevestigde tumoren is (figuur 3). Voer endoscopisch onderzoek wekelijks gedurende de duur van het therapeutische behandelingsperioden controleren tumorlast. Algemeen 4 weken een therapeutische behandeling volstaat een objectieve behandelingsrespons. Na de behandeling staken, kan een cohort van muizen ook worden gecontroleerd door middel van endoscopie voor tumor recidief. Euthanaseren muizen door CO 2 intoxicatie en weefsels voor biochemische en / of histologische analyse van de dikke darm en tumoren te verzamelen tijdens week 45, of na 4 weken van de behandeling. ve_title "> 5. endoscopische onderzoeken De endoscopie apparatuur wordt gemonteerd volgens standaardprocedures 16. Steriliseren en reinigen van de endoscoop probe met 70% ethanol of antibacterieel smeermiddel. Video's kunnen worden opgenomen met behulp van een laptop of desktop computer en standaard media software, zoals iMovie. Een standaardcomputerbeeldscherm plaats van een medische monitor, is voldoende om de dikke darm tijdens de endoscopie procedure (figuur 4) te visualiseren. Verdoven groepen van 5-6 muizen gelijktijdig in een kamer met 3% isofluraan in 100% O2 met een snelheid van 0,2-0,4 l / min. Zodra de muizen worden verdoofd, wat wordt bevestigd door teen knijpen; de isofluraan niveaus moeten worden veranderd om 0,5-2% voor onderhoud. Verwijder een individuele muis uit de kamer, en plaats het ventrale zijde omhoog met haar hoofd vastgezet in een neuskegel. Volledige narcose moet worden gevolgd en de achterpoten moet zo worden ingesteld dat ze stretched achter de muis. Plaats een dierenarts zalf op de ogen van de muizen tot droog voorkomen. Houd de staart van de muis waar het de onderrug duidelijk onthullen de anus. Plaats de starre endoscoop schede in een beker water en stel de luchtstroom naar de release van een kleine bubbel laten op een moment. De luchtstroom mogelijk de colon te blazen. Als de luchtstroom te sterk is, zal lucht worden gepompt in de maag van de muis. Geen extra smering nodig. Steek de starre endoscoop schede in het rectum zorgvuldig. In het algemeen kan de endoscoop worden ingebracht tot 3 cm, waarna het colon bij muizen bochten en is niet toegankelijk voor de stijve endoscoop. Een gemeenschappelijk probleem bij endoscopie procedures blokkering van de toegang tot het lumen van de darm als gevolg van fecale materie. Vermijd dit door zachtjes masseren van de buik van muizen voorafgaand aan de procedure ontlasting stimuleren of zorgvuldig manoeuvreren van de endoscoop om de Fecal kwestie tijdens de procedure. Peristaltiek kan ook optreden, waarbij de endoscoop dient plaats worden gehouden totdat het colon spieren ontspant. Initiëren video-opname in elk stadium van de endoscopie procedure. Ziekte scoren kan worden opgenomen door een ervaren medewerker in de procedure, of op een later tijdstip van de videobestanden. Naar aanleiding van de endoscopische examen, de terugkeer van de muizen om hun kooi en ze controleren tijdens het herstel van de anesthesie. Dieren zijn over het algemeen wakker en mobiel binnen 2 minuten na het verwijderen van de isofluraan toedienen neuskegel. Zorgen dat deze procedures worden uitgevoerd door een ervaren wetenschapper. Elke endoscopie procedure duurt ongeveer 2 min per muis nemen. 6. Ziekte Scoren Voor het bewaken colitis, score's voor het Muizen Endoscopische Index van Colitis Ernst (MEICS) 16, die veranderingen in documenten (i) de dikte van de darmwand aangegeven transparantie(Ii) ontlasting, (iii) de integriteit en aanwezigheid bloedvat, (iv) zweren en gebieden regeneratie die in een granulaire, (v) bloeden aangegeven met fibrine afzettingen (figuur 5a). Om tumorbelasting bewaken, scoren video's voor tumor incidentie en grootte. De tumorgrootte wordt bepaald door de diameter van de colon lumen bezet door de (figuur 5b) tumor 16. Het is gebruikelijk om zowel colitis en tumor scoren parameter te gebruiken voor een enkele muis. Met endoscopie, individuele tumoren en de gezondheid van de colonmucosa kunnen worden gevolgd in de tijd, die een uitlezing voor het succes van nieuwe therapeutica in een enkel dier. (Optioneel) Stilstaande beelden kunnen worden geëxtraheerd uit de video's voor het genereren van representatieve cijfers (figuur 6).

Representative Results

Gewichtsverlies wordt gebruikt als een standaard parameter te controleren op ziekten geassocieerd met colitis, die routinematig wordt gebruikt voor het bewaken van de algehele gezondheid van muizen. Dieren algemeen behouden van hun gewicht, terwijl DSS-bevattend water wordt toegediend, en pas aan los gewicht wanneer ze worden teruggestuurd naar de normale drinkwater. Aanvaardbaar gewicht-verlies parameters dienen in overeenstemming met de instelling dier ethische commissie worden opgericht. Om uitdroging gepaard met verlengde diarree te voorkomen, gebruikt de routinematige mash (voedsel pellets fijngestampt en gemengd met drinkwater) aangevuld met een shake naast de normale drinkwater. Als alternatief anesthesie, ketamine / xylazine of dergelijke kan worden gebruikt als isofluraan apparatuur niet beschikbaar. Vanwege de starre aard van de endoscoop, deze procedures slechts mogelijk voor visualisatie van de meest distale 3 cm van de muis colon. Nieuwer endoscopen met aanvullende mogelijkheden (zoals flexibiliteit en fluorescentie) zijn afhankelijk van de behoeften van het experiment. Omdat de schadelijke effecten van DSS hoofdzakelijk beperkt tot het distale colon van muizen met mildere pathologie waargenomen in het midden colon, de stijve endoscoop niet bewaking van de mucosale gezondheid van individuele muizen belemmeren. Hoewel we een protocol voor profylactische behandeling van acute DSS-geïnduceerde colitis beschrijven, kan dit protocol eenvoudig worden aangepast om interventie behandelingsstrategieën testen. De werkzaamheid van een geneesmiddel bedoeld voor epitheliale beschadiging en colitis verlichten kan longitudinaal worden gevolgd in individuele muizen en gekwantificeerd op basis van de scoring parameters beschreven (figuur 5). Dit is van voordeel boven traditionele experimentele ontwerpen die ruimen van muizen op specifieke tijdstippen vereisen tijdens de experimentele protocol en maakt karakterisering van de ziekte respons op behandeling tijd niet mogelijk. t "> Klinische studies bij mensen wisselvallig is hoe verschillende tumoren bij een individuele patiënt reageert op behandeling gemarkeerde. De procedures die hier zijn beschreven verschaffen een middel voor bewaken van tumorlast, en de respons op behandeling van individuele tumoren in de loop van een experiment. Het is belangrijk om te overwegen dat de interventie protocollen die worden beschreven voor de kankermodellen geen rekening met de effecten van een therapie op tumorinitiatie. profylactische protocollen, de behandeling voor tumoren wanneer zichtbaar door endoscopie worden, moeten deze informatie te verkrijgen. De hier beschreven protocollen geven informatie over de therapeutische effecten op de op de progressie (gemeten tumorgrootte) van individuele tumoren. Tumorregressie kan worden aangegeven door een vermindering van het aantal zichtbare tumoren. g "/> Figuur 1:. Monitoring effectiviteit van een profylactische behandeling therapie in een model van acute colon beschadiging Het experimentele protocol (a) vereist 8 dagen na aanvang tot voltooiing. Therapeutics toegediend (b) van dag 1 voor profylactische behandelingen. DSS wordt in het drinkwater (c) Dag 3 van het experimentele protocol. Endoscopie wordt uitgevoerd (d) de progressie van de ziekte in de dieren volgen. Stelde tijdstippen omvatten Dag 0 (onbehandeld) en Dag 2 (health monitoring), Dag 5 en 8 (aan de ziektelast te bepalen). Het experiment wordt beëindigd (e) de ochtend van dag 8. In een wildtype muis (f) de progressie van de ziekte tijd toeneemt. Figuur 2: Monitoring van de effectiviteit van de interventie therapie in een model of colitis-geassocieerde kanker. Het experimentele protocol (a) vereist 72 dagen van start tot oplevering. Therapeutics (b) toegediend aan muizen met gevestigde tumoren van dag 46 voor interventie behandelingen. AOM (c) wordt geïnjecteerd op dag 1, en ​​DSS wordt in het drinkwater in de loop van drie cycli van het experimentele protocol, beginnend op dag 8. Endoscopie (d) wordt uitgevoerd om de progressie van de ziekte in de dieren volgen. Stelde tijdstippen omvatten Dag 0 (onbehandeld), Dag 20 (health monitoring), en Dag 40 (aan de groep dieren volgens tumorbelasting). Endoscopie wordt uitgevoerd wekelijks de loop van de therapeutische behandeling onderzoeksresultaten te controleren. Het experiment (e) is de ochtend van dag 72. beëindigd In een wild-type muis (f) tumorbelasting verhoogt vanaf dag 40 en later. <img alt="Figuur 3"src = "/ files / ftp_upload / 52.383 / 52383fig3highres.jpg" /> Figuur 3:. Monitoring effectiviteit van interventietherapie in een model van spontane colorectale kanker Het experimentele protocol (a) vereist> 50 weken van begin tot voltooiing. Therapeutics (b) toegediend aan muizen met gevestigde tumoren interventie behandelingen. AOM (c) wordt geïnjecteerd op dag 1, en ​​daarna wekelijks gedurende 6 opeenvolgende injecties in de loop van het experimentele protocol. Endoscopie (d) wordt uitgevoerd om de progressie van de ziekte in de dieren volgen. Stelde tijdstippen omvatten Dag 0 (onbehandeld) en Week 8 (tumor monitoring) en tweewekelijks daar na (tot last van de tumor vast te stellen). Endoscopie wordt uitgevoerd wekelijks de loop van de behandeling therapeutische resultaten volgen. Het experiment (e) wordt beëindigd Week 50. In een wildtype muis (f) tumorlast toeneemt van Week 40 verder. </p> Figuur 4:. Apparatuur set-up De experimentele set-up (a) voor de endoscopische eenheid, met individuele onderdelen van de uitrusting aangegeven. De stijve endoscoop (b), met individuele componenten aangegeven. Schaal bar = 2,5 cm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 5:. Scoren ziekteparameters door endoscopie Een overzicht (a) van het Muizen Endoscopische Index van Colitis Ernst (MEICS). Een overzicht (b) van de afzonderlijke tumor scoring parameters.es / ftp_upload / 52.383 / 52383fig5highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 6: Vertegenwoordiger therapeutische behandelingen Vertegenwoordiger gewichtsverlies, endoscopische beelden en scores voor:. (A) Acute DSS-geïnduceerde beschadiging van het slijmvlies (b) Tumoren die zich ontwikkelde na de AOM / DSS-protocol (c) Tumoren die zich ontwikkelde na de sequentiële.. AOM protocol. N = 3 muizen per groep. * P <0,05, *** p <0,001 (t-toets). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

De drie protocollen die worden beschreven overzicht methoden van betrouwbare en reproduceerbare inductie van colon ziekte pathologie bij muizen. In combinatie met de systematische endoscopische monitoring en de interventiestrategieën hier geschetst, zullen deze protocollen krachtige pre-klinisch inzicht in de effectiviteit van geneesmiddelen te verstrekken. Onze laboratoria routinematig gebruikt al deze protocollen voor het succes van nieuwe therapieën 10,23,24 controleren.

Er zijn een aantal overwegingen bij het kiezen van een preklinisch diermodel om nieuwe therapieën te testen. Deze omvatten relevantie van het model voor de menselijke ziekte, en de bijdrage van de tumor micro de voorgestelde maatregel van de therapeutisch doel. Hier bieden we drie protocollen voor therapeutische interventie in gevestigde darmziekte modellen. Deze modellen zijn reproduceerbaar en de levering van reagentia ziekte induceren eenvoudig te beheren. Belangrijk is dat de modellen zijn zeer relevantom meerdere facetten en stadia van colitis ontstaan, en van de tumor initiatie en progressie. Onderzoekers moeten rekening houden met de genetische achtergrond van de muizenstammen gebruikt bij het ​​ontwerp experimenten, zoals de gevoeligheid voor ziekte geïnduceerd met DSS en / of AOM kan sterk 25 variëren. Bovendien kunnen verschillende microbiële gemeenschappen verschillende metabolische capaciteiten in de context van AOM, die wordt gemetaboliseerd door bacteriën. Wij waarschuwen tegen het gebruik van verschillende cohorten van muizen die werden geboren in verschillende dieren (met inbegrip van commerciële leveranciers) in een enkel experiment. Evenzo kunnen de verschillende microflora in muizen gebruikt van verschillende faciliteiten lokken verschillende gastheerreacties DSS-geïnduceerde epitheliale barrière schade 11. Bovendien moet het juiste analyse van weefsel (bijvoorbeeld RNA zuivering) worden beschouwd, aangezien de mogelijkheid van DSS om reverse transcriptase invloed op daaropvolgende moleculaire analyse 26,27 remmen.

<p class = "jove_content"> Muis endoscopie is een cutting edge techniek om herhaaldelijk te controleren begin van de ziekte en de progressie in een individuele muis. De mogelijkheid om video's op te nemen en uit te pakken stilstaande beelden maakt een eenvoudige bewaking van verschillende ziekteparameters en tumoren. Naast het verbeteren van dierenwelzijn endoscopische controle vermindert ook de noodzaak voor meerdere cohorten van experimentele muizen, die traditioneel werden afgemaakt op verschillende tijdstippen ziekte resultaten volgen. De MEICS scoresysteem is geen vervanging voor histopathologische analyse, maar biedt een alternatief middel om de gezondheid en het mucosale schade door dieren in levende muizen te monitoren. Mouse endoscopie is een gespecialiseerd laboratorium techniek, en alle procedures worden uitgevoerd door geschoold personeel passende manipulatie en behandeling van de muizen te waarborgen, en om een ​​constante kwaliteit van de beelden voor ziekte scoren verschaffen. In de handen van gekwalificeerd personeel, hebben we ontdekt dat endoscopie induceert weinig of geen schade aan de Tumors die zou leiden tot intra-tumorale bloeden. Voor de therapeutische protocollen uiteengezet, beschouwen we endoscopie zeer voordelig, aangezien het voorziet in een manier om de oorspronkelijke tumor belasting bepalen, en kunnen we cohorten groep dieren met gelijke tumorlast vóór de toediening van een therapeutisch geneesmiddel. Sequentiële bewaking van de muizen kunnen onderzoekers de effectiviteit van nieuwe therapieën vroeg bepalen met de optie beëindigen mislukte experimenten tijdig.

Aangezien ons begrip van ontstekingsdarmziekte en colorectale kanker voren, zullen nieuwe targets voor therapie worden geïdentificeerd. Gepaste diermodellen zal een integraal onderdeel van ervoor te zorgen dat de meest veelbelovende nieuwe therapieën worden verplaatst in de richting van de klinische proeven zijn.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) MP Biochemicals 160110 Requires batch testing.
Azoxymethane Sigma A5486-100MG Requires batch testing.
Vanilla Protein Shake N/A N/A Available from hospital pharmacies.
Isoflourane PPC M60303 This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key.
70% Ethanol N/A N/A Standard lab reagent.
Coloview miniendoscopic system
Endovision Tricam Karl Storz 20212001-020
Xenon 175 light source with anti-fog pump Karl Storz 20134001
HOPKINS straight Forward Telescope Karl Storz 64301AA
Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) Kalr Stroz 61029C
Fubre Optic Light Cable Kalr Stroz 69495ND
Computer and media player software MAC, imovies
Scale Any Any scale suitable for weighing mice.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, 353-358 (2009).
  2. Rustgi, A. K. The genetics of hereditary colon cancer. Genes Dev. 21, 2525-2538 (2007).
  3. Rutter, M., et al. Severity of inflammation is a risk factor for colorectal neoplasia in ulcerative colitis. Gastroenterology. 126, 451-459 (2004).
  4. Eaden, J. A., Abrams, K. R., Mayberry, J. F. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut. 48, 526-535 (2001).
  5. Lakatos, P. L., Lakatos, L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis: changes, causes and management strategies. World J Gastroenterol. 14, 3937-3947 (2008).
  6. Xiang, B., Snook, A. E., Magee, M. S., Waldman, S. A. Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med. 15, 301-308 (2013).
  7. Feng, Q. Y., et al. Anti-EGFR and anti-VEGF agents: Important targeted therapies of colorectal liver metastases. World J Gastroenterol. 20, 4263-4275 (2014).
  8. Dinarello, C. A. Anti-inflammatory Agents: Present and Future. Cell. 140, 935-950 (2010).
  9. Grivennikov, S. I., et al. Adenoma-linked barrier defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour growth. Nature. 491, 254-258 (2012).
  10. Putoczki, T., Thiem, S., Loving, A., Busuttil, R. A., Wilson, N. A., Ziegler, P., Nguyen, P., Preaudet, A., Farid, R., Edwards, K., Boglev, Y., Luwor, R. B., Jarnicki, A. J., Horst, D., Boussioutas, A., Heath, J., Sieber, O., Nash, A., Greten, F., McKenzie, B. S., Ernst, M. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell. 24, 257-271 (2013).
  11. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
  12. Rose, W. A., Sakamoto, K., Leifer, C. A. Multifunctional role of dextran sulfate sodium for in vivo modeling of intestinal diseases. BMC Immunol. 13, 41 (2012).
  13. Laroui, H., et al. Dextran sodium sulfate (DSS) induces colitis in mice by forming nano-lipocomplexes with medium-chain-length fatty acids in the colon. PLoS One. 7, e32084 (2012).
  14. Miyazawa, F., Olijnyk, O. R., Tilley, C. J., Tamaoki, T. Interactions between dextran sulfate and Escherichia coli ribosomes. Biochim Biophys Acta. 145, 96-104 (1967).
  15. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14, 141-153 (2014).
  16. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2, 1998-2004 (2007).
  17. Schwitalla, S., et al. Loss of p53 in Enterocytes Generates an Inflammatory Microenvironment Enabling Invasion and Lymph Node Metastasis of Carcinogen-Induced Colorectal Tumors. Cancer Cell. 23, 93-106 (2013).
  18. Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. 40, 2436-2445 (1977).
  19. Chen, J., Huang, X. F. The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications. Cancer Biol Ther. 8, 1313-1317 (2009).
  20. Bollrath, J., et al. gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell. 15, 91-102 (2009).
  21. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1, 2900-2904 (2006).
  22. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, 485-498 (2009).
  23. Thiem, S., et al. mTORC1 inhibition restricts inflammation-associated gastrointestinal tumorigenesis in mice. J Clin Invest. 123, 767-781 (2013).
  24. Stuart, E., et al. Therapeutic inhibition of Jak activity inhibits progression of gastrointestinal tumors in mice. Mol Cancer Ther. 13, 468-474 (2014).
  25. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
  26. Viennois, E., Chen, F., Laroui, H., Baker, M. T., Merlin, D. Dextran sodium sulfate inhibits the activities of both polymerase and reverse transcriptase: lithium chloride purification, a rapid and efficient technique to purify RNA. BMC Res Notes. 6, 350 (2013).
  27. Kerr, T. A., et al. Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution. Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).

タグ

Non-invasive AssessmentTherapeutic EfficacyIntestinal PathologiesEndoscopic ImagingLive MiceAnimal ModelsInflammatory Bowel DiseaseColorectal CancerPre-clinical StudiesAcute Mucosal DamageChronic ColitisColitis-associated Colon CancerSporadic Colorectal CancerSerial Endoscopic ExaminationTherapeutic ResponseHealth Monitoring

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Ernst, M., Preaudet, A., Putoczki, T. Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice. J. Vis. Exp. (97), e52383, doi:10.3791/52383 (2015).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image