Méthodes pour évaluer la cytotoxicité et l'immunosuppression des préparations de produits combustibles tabac
概要
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Parmi les autres modifications physiopathologiques, l'exposition chronique à la fumée de cigarette provoque une inflammation et une suppression immunitaire, qui ont été liés à une sensibilité accrue des fumeurs à des infections microbiennes et l'incidence des tumeurs. Ex vivo suppression des réponses immunitaires médiés par les récepteurs dans les cellules mononucléaires périphériques humaines du sang (PBMC) traité avec constituants de la fumée est une approche intéressante pour étudier les mécanismes et d'évaluer les effets probables à long terme de l'exposition aux produits du tabac. Ici, nous avons optimisé méthodes pour effectuer des dosages ex vivo en utilisant des PBMC stimulés par un lipopolysaccharide bactérien, un récepteur de ligand-4 de type Toll. Les effets de milieu de la fumée conditionné ensemble (WS-CM), une préparation de produits du tabac combustible (TPP), et la nicotine ont été étudiés sur la sécrétion de cytokines et de destruction des cellules cible par les PBMC dans les tests ex vivo. Nous montrons que des cytokines sécrétées IFN-γ, le TNF, l'IL-10, IL-6 et IL-8 et des cytokines intracellulaires IFN47 ;, TNF-α, MIP-1α et ont été supprimées dans les CMSP WS-CM-exposées. La fonction cytolytique des PBMC effectrices, telle que déterminée par un dosage de cellules cibles K562 tuant a également été réduite par exposition à WS-CM; la nicotine est très peu efficace dans ces essais. En résumé, nous présentons un ensemble de tests améliorés pour évaluer les effets du PPT en essais ex vivo, et ces méthodes pourraient être facilement adaptés pour tester d'autres produits d'intérêt.
Introduction
Un ensemble considérable de points de connaissances sur les effets néfastes sur la santé du tabagisme chronique, notamment les maladies cardiovasculaires (MCV), la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) et le cancer 1,2. Chronique tabagisme a été connu pour causer l'inflammation et l'immunosuppression, et ces modifications sont signalés à contribuer à un risque accru d'infection microbienne et le cancer chez les fumeurs 3. In vitro et ex vivo techniques sont utiles pour élucider la base moléculaire des effets physiopathologiques de la fumée de cigarette 4-9 (tableau 1) et sont reconnus comme des outils importants pour guider la réglementation émergent de différents produits du tabac 10,11.
Par exemple, nous avons démontré que les préparatifs combustibles de produits du tabac (PPT) comme milieu complet de fumée conditionné (WS-CM) et la matière particulaire totale (TPM) sont beaucoup plus cytotoxique et dommageable pourADN que PPT non combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l'ouvrage publié, il a été récemment rapporté que PPT combustibles ou de la nicotine 12,13. Conformément à l'ouvrage publié, nous avons récemment signalé que PPT combustibles causés immunosuppression marquée. Ceci a été démontré par la suppression de Toll Like Receptor (TLR) -ligands, stimulé la sécrétion de cytokines, et la cellule ciblée (K562) tuer par les PBMC dans un modèle ex vivo 14. Étant donné l'importance de l'inflammation dans les processus de la maladie induite fumée cigarettes, poursuite de l'optimisation des conditions d'essai pour évaluer les effets immunomodulateurs de la fumée de cigarette est présenté dans ce rapport.
Les essais ex vivo typiquement mesurés et intracellulaire des cytokines ainsi que la fonction cytolytique de cellules NK et T cytotoxiques dans la cellule K562 tuant des dosages 14 sécrétées. Les dosages impliqués pré-incubation avec WS-CM et la nicotine et la stimulation ultérieure de PBMCs avec agonistes de TLR pendant une période de 3 jours; les lectures finales sont effectuées en utilisant des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) et / ou la cytométrie de flux. Nous avons utilisé le lipopolysaccharide bactérien (LPS), qui se lie à des récepteurs TLR-4 stimule les PBMC et conduisant à la production de cytokines intracellulaires et la sécrétion de cytokines. En plus de l'optimisation des différentes étapes essai pour l'évaluation des effets immunomodulateurs de PPT, nous avons également présents procédés pour isoler les PBMC, des dosages de mort cellulaire et de l'IL-8 quantification. Ces méthodes peuvent être appliquées pour aborder d'autres questions de recherche et affinés pour évaluer les produits du tabac dans le contexte réglementaire.
Tableau 1. Publié rapports de in vitro et ex vivo méthodes utilisées pour étudier les effets physiopathologiques Varilux de préparations de produits du tabac CS, le milieu de la fumée de cigarette. SCC, la fumée de cigarette condensat; CST, cigarette extrait de fumée; ELISA, enzyme dosage immunoenzymatique; GADPH, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase; qPCR, réaction quantitative en chaîne par polymérase; RT en temps réel réaction en chaîne par polymérase quantitative; TS, la fumée de tabac.
| Auteur (Année de l'étude) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Les cellules utilisées | Cellules bronchiques humaines de l'endothélium (BEAS-2B), les neutrophiles humains | Cellules épithéliales alvéolaires humaines (A549) | Les cellules musculaires lisses des voies respiratoires humaines (HASMC) | Cellules U937 prémonocytique humaines, des monocytes humains | Alvéolaires de type II cellules épithéliales (ATII) | Monocytaire humainelignée cellulaire (THP-1), les macrophages pulmonaires humaines |
| TPP utilisé | CST | SCC | CST | TS | CST | CS |
| Méthode utilisée | ELISA, qPCR, la migration, l'électromobilité changement | Immuno-chimie, électrophorèse, kit ArrayScan, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, PCR quantitative, l'électrophorèse | Gel-décalage de mobilité | La microscopie optique, la microscopie électronique, l'électrophorèse, ELISA | qPCR, ELISA, kit E-TOXATE (Sigma), plaque de p65 dosage (TransAM), électrophorèse, diverses trousses d'immunoessais |
| Mesure | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migration | histones acétyltransférases, les histones désacétylases, NF-kB, IL-8, pI-kB α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, l'éotaxine | Heat Shock / protéines de stress (HSP / Hsp70), HF facteur de transcription NF-kB,TNF-α | Protéine tensioactif (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, le TNF-α, IL-1β, l'IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, α-MIP1, GRO-α, MAPK / JNK / phosphorylation de ERK, cJun: liaison à l'ADN, le glutathion, p65: liaison à l'ADN |
| Résultat final | CST régule à la baisse la production de cytokines par la suppression de l'AP-1 activation. | H 2 O 2 et SCC améliorer acétylation des histones, diminuer l'activité histone déacétylase, différentielle régulent la libération de cytokines pro-inflammatoires. | La fumée de cigarette peut causer la libération d'IL-8 de HASMC, renforcée par le TNF-α, 20% moins CST IL-8 libération, inhibition de l'éotaxine et RANTES par la fumée de cigarette. | TS HF activés facteur de transcription qui a été associée à la surexpression de la Hsp70 et l'inhibition de l'activité NFkB et de TNF-α libération de liaison. | Réduction ATII niveaux de chimiokines dérivées de cellules compromis alveolar réparation, contribuant à la cigarette induit fumée lésions alvéolaires et l'emphysème. | Données fournissent explication mécaniste pour les infections respiratoires pourquoi les fumeurs ont augmenté. Suppression de la réponse innée se accompagne d'une augmentation de l'IL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous et d'autres avons précédemment démontré que le traitement des PBMC avec PPT inhibe plusieurs réponses, y compris l'expression et la sécrétion de cytokines et les mesures fonctionnelles telles que la cellule cible 14 tuant. Les méthodes expérimentales décrites dans l'ouvrage précédent nécessitent des périodes d'incubation plus longues et ont été modestes en amplitude 14. Étant donné les applications potentielles de cette jolie modèle ex vivo pour la r…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est financé par RJ Reynolds Tobacco Company (de RJRT) en vertu d'un accord de collaboration de recherche avec l'École de médecine Wake Forest University. GL Prasad est un employé à temps plein de la RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
参考文献
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