Préparation et respirométrique évaluation des mitochondries isolées de tissu musculaire squelettique Obtenu par biopsie percutanée aiguille

REMARQUE: Le protocole décrit a été approuvé par le Conseil de l'École de médecine de Wake Forest Institutional Review. Le consentement éclairé a été obtenu par écrit. Tous les participants étaient des adultes âgés en bonne santé (65 à 79 ans) des deux sexes, ayant un IMC allant de 23 à 35. 1. Skeletal Muscle biopsie Comme décrit précédemment, neuf effectuer toutes les biopsies en début de matinée après une O / N rapide. Demandez aux sujets de se abstenir de prendre de l'aspirine, de prescription et over-the-counter médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens, ou d'autres composés qui peuvent affecter des saignements, des plaquettes, ou des ecchymoses pour la semaine avant la biopsie. Demandez aux participants de se abstenir également de toute activité physique intense pendant au moins 36 heures avant la biopsie. REMARQUE: Muscle est obtenu à partir du vaste externe en utilisant la technique aiguille de biopsie percutanée avec une aiguille percutanée sous anesthésie locale avec 1% de lidocaïne. Pas de complications médicales ou other signalé les effets indésirables de la procédure ont eu lieu dans notre unité de recherche clinique. NOTE: La procédure de biopsie décrite est adaptée de celle de 10 Bergstrom. Brièvement, administrer localement une prise% de lidocaïne soin de ne pas se infiltrer dans le muscle. Suivez ce avec une période d'attente de 10 min pour permettre engourdissement suffisante. Prenez les biopsies du ventre du muscle (la région centrale du muscle entre l'insertion et de l'origine) en évitant les zones sous-aponévrotique et myotendonous. Utilisez percutanée à l'aiguille (un appareil réutilisable d'aspiration assistée avec un côté fenêtre et cylindre de coupe intérieure de coupe) et de suivre un aponévrotique «pop» ou la résistance de l'aponévrose comme un guide. Estimer la profondeur avec l'aiguille d'anesthésie, puis de nouveau sentir avec la lame de bistouri étroit et faire une incision de 4-5 mm à travers le fascia. Avancer l'aiguille à travers l'incision jusqu'à ce qu'elle soit insérée dans le muscle. Recueillirplusieurs échantillons avec la fenêtre tournés dans des directions différentes. Appliquer une aspiration continue à l'aide d'une seringue de 60 cc en avançant et en retirant des échantillons de muscles dans l'aiguille percutanée deux à quatre fois dans des directions différentes. Cesser d'aspiration et de retirer l'aiguille. NOTE: Chaque passage (insertion et le retrait de l'aiguille) devraient prendre moins d'une minute. Demander à un assistant applique une pression ferme pour percer site pour 5 min à établir l'hémostase. Débranchez aiguille du tuyau d'aspiration et enlever soigneusement échantillons de muscles de la fenêtre et le baril. Faire une deuxième passe si plus de muscle est nécessaire en répétant la procédure ci-dessus. Retirez les caillots de sang de l'échantillon musculaire en utilisant une pince, peser l'échantillon, et le placer immédiatement dans un tube contenant du DPBS glacées. NOTE: Le rendement moyen en utilisant cette méthodologie est de 150 ± 20 mg. 2. Isolement mitochondriale <ol> Fraîchement préparer le Chappel-Perry (CP) et mitochondrial Dosage Solution (MAS) tampons (tableau 1) le jour de l'expérience, ou aliquote et de les stocker à -20 ° C. Préparer les composés dans du diméthylsulfoxyde à une concentration de 2,5 mM et aliquote et stocker à -20 ° C. Utilisez les aliquotes de tampon et de composés stockées à -20 ° C dans les 2 mois à partir du jour de préparation. Retirer le tissu conjonctif visible de l'échantillon en utilisant ciseaux et des pinces acérées; si nécessaire l'utilisation d'un microscope binoculaire pour cette étape. Laver soigneusement les spécimens 3-4 fois avec un tampon de DPBS glacé pour éliminer le sang. Gardez les échantillons sur DPBS et processus glacés dès que possible, en prenant soin de ne pas dépasser plus de 45 min de biopsie. Prenez des précautions pour retirer soigneusement tous les tendons ou les tissus adipeux de l'échantillon de muscle. Hacher immédiatement le tissu musculaire en petits morceaux à l'aide d'une paire de ciseaux stériles et de suspendre dans 500 pi à 1 ml contenant IPC proteinase (Nagarse) à une concentration de 0,2 mg / g de tissu. Suivez ce avec une incubation de 5 min à température ambiante, puis les transférer à la glace. Homogénéiser les tissus hachés traités avec l'aide d'un homogénéisateur Nagarse automatisé. Conserver l'échantillon sur la glace tout au long de ce processus. Homogénéiser chaque échantillon de tissu à quatre reprises, chaque fois pour une impulsion de 2 secondes, aide de l'homogénéisateur automatisé à un réglage de vitesse de 10 000 tours par minute. Laver la sonde avec de l'éthanol à 70% puis à l'eau distillée entre les tissus. Laver le tissu homogénéisé avec un volume égal de CP I (500 ul à 1 ml) et 2x volume de CP II (1 ml à 2 ml), et de recueillir le contenu dans un tube de centrifugation et centrifuger à 600 xg, 4 ° C pendant 10 min. Passez le surnageant à travers une étamine mouillée, recueillir le filtrat et jeter le culot, éliminant ainsi la majorité des fractions non-mitochondriales. 3. laver les mitochondries Centrifuger le surnageant provenant de l'étape ci-dessus à 10,000 xg, 4 ° C pendant 10 min. Suspendre le culot dans 4 ml de CP II tampon et encore centrifuger à 10 000 xg, 4 ° C pendant 10 min. NOTE: En de rares occasions, une fine pastille de sang est formée en dessous le culot mitochondrial. Dans ce cas, retirez le culot de mitochondries par aspiration douce avec un tampon de CPII. Cette étape peut être évité en lavant soigneusement le sang à l'étape 2. Suspendre le culot obtenu à 2 ml de tampon CP I. A ce stade, utiliser une petite aliquote de cette suspension pour l'estimation de la protéine. Reprendre l'échantillon restant dans CP I tampon et centrifuger comme décrit. Suspendre le culot final dans une quantité minimale (200 pi) de mitochondrial Assay Solution (MAS). REMARQUE: Les protéines sont dosés à ce stade car tampon CP I n'a pas BSA, alors que MAS dans laquelle les échantillons seront suspendus tard ne avoir BSA en elle. 4. Estimation du contenu mitochondrial par mesure Concentration en protéines aide d'un kit de dosage de protéines BCA <pclass = "jove_content"> NOTE: Utilisez cette concentration pour calculer la quantité de mitochondries utilisés pour le chargement sur une microplaque de 24 puits pour les mesures respirométriques, ou pour des expériences de Western blot. Prendre en compte le facteur de dilution (10) pour le calcul de la concentration en protéines. 5. Effectuer les tests XF comme décrit par Rogers, GW, et al. 12 REMARQUE: Visualiser le taux de consommation d'O 2 (OCR) en O 2 pmoles / min, ou les niveaux absolus de O 2 et un pH dans la sortie de données. Utilisez 1x MAS pour préparer des composés à injecter. Ajouter une concentration 10X des composés aux ports AD pour donner une concentration finale comme suit: Port A, ADP [Adénosine 5 '-diphosphate, 2 mM, 50 ul]; le port B, oligomycine (2 uM, 55 ul); le port C, FCCP [carbonyl cyanure 4- (trifluorométhoxy) phénylhydrazone, 6 pm, 60 pi]; et le port D, 2 uM antimycine-A (65 pi). Préparerun volume suffisant de composés pour le nombre requis de puits. Déterminer la quantité optimale de mitochondries par titrage. Par exemple, charge 1,0 ug, 2,5 ug, 5,0 ug et de la mitochondrie par puits dans un volume de 50 ul de 1 x glacées contenant MAS substrat. Pour minimiser la variabilité entre les puits, d'abord dilué 10x mitochondries dans le substrat 1x MAS + froid. Ensuite, 50 ul de fournir cette suspension dans chaque puits (à l'exception des puits de correction d'arrière-plan). Centrifuger la plaque à 2000 xg, 20 min à 4 ° C. Après centrifugation, ajouter doucement 450 ul de 1 x MAS succinate + (10 mM) et la roténone (2 pM) (conditions initiales, voir ci-dessous) à chaque puits. Voir les mitochondries sous le microscope pour assurer le respect homogène pour le bien avant de transférer la plaque à l'analyseur XF. REMARQUE: Les conditions initiales utilisées dépendra de savoir si la respiration est entraîné soit par ETC I ou II du complexe complexe. Pour la respiration complexe entraîné II, utilisez succinate (10 mM) et la roténone (2 uM) en tant que conditions initiales. blocs de roténone I et succinate complexe fournit le carburant pour les complexes II (succinate déshydrogénase). Pour étudier la respiration entraînée par complexe I, appliquez une pyruvate et malate, chacun à une concentration finale de 5 mM de glutamate ou malate et chacun à une concentration finale de 10 mM en tant que conditions initiales. Celui-ci peut aider à distinguer entre la dysfonction cycle de Krebs et de transport de substrat. Pour étudier la respiration entraînée par deux I et II du complexe complexe, notamment pyruvate et succinate sans roténone ou malate comme conditions initiales. Utilisation palmitoyl carnitine en tant que substrat pour β-oxydation. Mesurer séquentiellement la respiration mitochondriale en temps réel en utilisant le respiromètre par elle programmation comme décrit précédemment 12. Utilisez les paramètres pour le respiromètre fourni dans le tableau 2. REMARQUE: Une brève explication des différents états de la respiration mitochondriale sont comme suit: <li> État 2 = état couplé avec le substrat présente; 3 = Etat de phosphorylation respiration en présence de saturer ADP; Etat 4 o = non-phosphorylation induite par la respiration oligomycine; 3u État = maximale respiration découplé stimulé par le FCCP découplant; Résiduelle non mitochondrial respiration = respiration après complexe III inhibition par antimycine-A. Il convient également de rappeler que, la longueur de la mesure OCR en combinaison avec la concentration mitochondrial pourrait influencer les données en épuisant l'oxygène au cours des périodes de mesure. 6. Western Blot NOTE: Déterminer le marqueur mitochondrial COX IV et GAPDH de tissu entier par Western blot pour assurer l'enrichissement des mitochondries dans l'échantillon final Séparez les mitochondries isolées et l'extrait de tissu entier de 12% dodécyle sulfate de sodium gels de polyacrylamide. Transférer les protéines sur un polyfluorure de vinylidène (PVDF). Incuber avec l'anticorps COX IV (1: 20.000), suivi par la peroxydase de raifort (HRP) conjugué à des anticorps secondaires. Pour la détermination de GAPDH, dépouiller la tache et la sonde avec un anticorps monoclonal GAPDH (1: 2000). NOTE: Si les différences dans la contamination de l'ER sont préoccupantes, notamment marqueurs ER tels que ERp72, calnexine ou la calréticuline dans l'analyse.