Подготовка и Respirometric Оценка митохондрий, изолированных от скелетной мышечной ткани, полученные чрескожной пункционной биопсии
概要
Методы биопсии латеральной широкой, подготовки очищенной митохондрий, и respirometric профилирования описаны. Использование небольшого объема мышц делает этот метод подходит для клинических исследований применения.
Abstract
Respirometric профилирование изолированными митохондриями обычно используется для изучения электронного функцию транспортной цепи. Мы опишем метод получения образцов человека латеральной широкой мышцы бедра, изолируя митохондрии от минимальных количествах скелетной мышечной ткани, и толстого листа на основе respirometric профилирование с помощью внеклеточного поток (XF) анализатор. Сравнение respirometric профилей, полученных с помощью 1,0, 2,5 и 5,0 мкг митохондрий показывают, что 1,0 мкг достаточно измерить дыхание и 5,0 мкг обеспечивает наиболее стабильные результаты на основе сравнения стандартных ошибок. Вестерн-блот анализ изолированных митохондриях митохондриальных маркеров ЦОГ IV и без митохондриальной ткани маркера GAPDH показывают, что существует ограниченное, не митохондриальная загрязнение с помощью этого протокола. Способность к обучению митохондрий респирометрии в качестве лишь 20 мг мышечной ткани позволяет пользователям использовать отдельные биопсии для нескольких конечных точек исследования в клиническойнаучно-исследовательские проекты.
Introduction
Митохондрии являются основными производственные участки энергии в клетке и играют важную роль в старении, а также различные нарушения, связанных с возрастом, таких как сердечно-сосудистые заболевания, болезни Альцгеймера, сахарного диабета, рака и ожирения. Respirometric профилирование изолированными митохондриями обеспечивает прямой анализ (ETC) функции электрон-транспортной цепи и внес значительный вклад в наше понимание митохондриальной биологии и его роль в здоровье и болезни. Изолированные митохондрии используются для изучения различных аспектов биоэнергетики, как, подложки транспорта, АТФ-синтазы, утечки протонов и т.д. методика, описанная в этой рукописи был оптимизирован для обеспечения respirometric анализ митохондрий, выделенных из скелетных биопсии мышечной ткани, полученных из человеческих субъектов. Протокол биопсия описано в этой рукописи была использована наших сотрудников за последние 12 лет. Наша группа выступала более 700 процедур на взрослых разного возраста,до 90 лет, и с различными условиями хронические болезни без каких-либо побочных вопросам безопасности. Ключевым аспектом этого протокола является то, что он разработан специально для использования в минимальных количествах ткани, способствуя тем самым ее использования в клинической исследований.
Различные протоколы были разработаны для выделения митохондрий. Фернандес-Vizarra др. 1,2 описан способ выделения митохондрии из различных тканей крыс, а также культивируемых клеток. Garcia-Cazarin др. 3 сообщают способ выделения митохондрии из скелетных мышц крысы и мыши. Способ выделения митохондрии из головного мозга крысы была также сообщает Iglesias-Gonzales и др., 4 Gross и др. 5 описан способ выделения митохондрии с помощью barocycler и / или измельчитель РСТ. В последнее время Франко и др. 6 описан способ выделения высоко обогащенного митохондрии с использованием анти-TOM22 Магнитные шарики.
В то время как эти протоколы дают превосходные результаты, требования к размеру ткани являются высокими по сравнению со способом, описанным в этой рукописи. Например, Гросс и др. 5 используется 1,5-1,8 г икроножной мышцы, и около 2 г в почечной ткани. Кроме того, Франко и др. 6 используется 500 мг печени мыши ткани. Исходя из нашего опыта, типичные выходы можно ожидать от чрескожной биопсии скелетных мышц (латеральной широкой) в диапазоне от 100-200 мг. Способность оценивать функции митохондрий в 20-50 мг мышечной ткани, используя протокол, описанный здесь позволяет пользователям выполнять несколько оценок в биопсии и хранения образцов для дальнейшего использования в других опытах молекулярной биологии. Это важная особенность, в клинических исследованиях и других исследований, которые требуют надлежащее использование образцов. Следует отметить, что предварительно замороженные митохондрии не подходят для изучения в сочетании дыхания вследствие Outeг повреждение митохондрий мембраны и потери цитохрома С деятельностью. Наш метод был адаптирован и изменен с методом, опубликованной Chappell и Перри 7.
Используя методы, описанные в этой рукописи, мы недавно сообщили, что respirometric профиль митохондрий, выделенный из человеческой латеральной широкой непосредственно коррелирует с физической способностью, измеряемой как скорость походки 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изолированные митохондрии часто используются в исследованиях, посвященных изучению роли функции и т.д., а также другие митохондриальные деятельности, в том числе подложки транспорта и функции ЦТК. Respirometric анализ с использованием изолированных органелл позволяют прямое изучение основных процессов окислительного фосфорилирования и внутренних свойств Т.Д. Respirometric профилирование изолированными митохондриями по сравнению с целыми клетками или проницаемыми мышечных волокон имеет преимущества относительно простой интерпретации данных и отсутствие «вмешательства» из не-митохондриальных процессов или изменений в митохондриальной массы / биогенеза. Нормализация данных на основе митохондриальной содержание белка, тем самым позволяя простой поперечное сравнение между образцами митохондрий. Respirometric профилирование изолированной митохондрии предпочтительный подход, когда Целью исследования является определение основных механизмов и определения конкретных целей, таких как ETC компонентаS / комплексы, или митохондриальных транспортных механизмов.
Описывается протокол для биопсии мышц и изоляции функциональной митохондрий маленькие образцы ткани. Этот метод дает воспроизводимые результаты между пользователями из-за использования автоматизированной гомогенизатор против ручные DOUNCE гомогенизаторы. Выделение митохондрий может быть выполнена с всего лишь 20 мг мышечной ткани. Количество изолированных митохондрий, которые могут быть получены из этого размер выборки является достаточным для запуска Seahorse пластины на основе респирометрии, оставляя излишков митохондрии для других экспериментов и хранения для дальнейших анализов молекул. Следует отметить, что этот метод может быть переведен в XF 96, где даже небольшие количества митохондрий может быть использован (1-2 мкг на лунку).
Несколько протоколов для выделения митохондрий полагаться на DOUNCE Гомогенизаторы для разрушения исходной ткани. Недостатком этого способа является то практический природы исходного тканигомогенизации. Сила и скорость пестиком в гомогенизаторе может значительно варьироваться в зависимости от операторов 6. Это может привести к опыта к эксперименте изменения, а также лаборатория-к-лаборатории изменения, и приводит к затруднению в сравнения данных между экспериментами. Это вызывает особую озабоченность в исследованиях человеческого вмешательства, когда данные из участников собираются на отдельных временных точках, как правило, до и после лечения, и, возможно, на нескольких площадках. Мы используем автоматизированные гомогенизатора для более последовательного подхода, который дает более воспроизводимые результаты с ограниченной вариации от человека к человеку. Скорость подготовки также делает этот подход, подходящий для обработки нескольких образцов одновременно. Как правило, до трех экспериментах может быть выполнена в течение одного дня.
Потенциальные ограничения методике, описанной здесь возникают из-за использования отдельных органелл и использование формата пластины основе. Например, Picard и др. есть демонstrated, что изолированные митохондрии обладают функциональными характеристиками, принципиально отличающиеся от интактных митохондрий в пермеабилизированных мышечных волокон. Они предположили, что митохондриальные методы изоляции привести к изменению биоэнергетического функции, такие как значительно увеличился RCR по сравнению с проницаемыми мышечных волокон сопровождается продукцией видов больше активного кислорода 13. По сравнению с проницаемыми мышечных волокон, изоляция митохондрий требует больше времени на подготовку. Кроме того, потеря сотовой содержанием уменьшается физиологическое значение, то, что остается в целых клетках и даже проницаемыми волокон. Использование пластины на основе респирометрии с описанными разрешений техники воспроизвести трасс в образце. Тем не менее, митохондрии должен присоединиться к нижней части каждой лунки. Эта конфигурация отличается от их нормальной окружающей среды и может повлиять на функциональные характеристики. Кроме того, следует отметить, что при использовании этого протокола для митохондриальной изоляции, Therе все еще может быть загрязнение от эндоплазматического ретикулума (ER) в митохондриальной препарата. Различия в загрязнение ER может повлиять на определение митохондриальной доходности и повлиять на результаты.
В заключение следует отметить, что это исследование представляет данные, которые подтверждают, что митохондрии, выделенные из тканей с использованием этой процедуры являются функционально активными и могут быть использованы для исследований / приложений, которые требуют высокого качества изолированные митохондрии из минимального количества скелетных мышц образцов. Преимущество этого метода состоит в том, что: I) можно выделить митохондрии от минимальных количеств скелетных мышц, II) процедура является быстрым, III) с технологией пластины основе, можно использовать несколько образцов в то же время, и IV) существует достаточно излишек ткани и изолированные митохондрии после биоэнергетического анализа для хранения образцов и других молекулярно-биологических исследований.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.
Materials
| Equipment | ||
| Name of the Equipment | Company | |
| Homogenizer Bio-Gen PRO200 | BioExpress | |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Fisher Scientific | |
| Deepwell late Rotor | Fisher Scientific | |
| 6mm University College Hospital Needle | Cadence | |
| 60cc syringe | Fisher Scientific | |
| 96-well plate reader | Tecan (Genios-basic) | |
| Seahorse XF 24-3 analyzer | Seahorse Biosciences, Inc. | |
| Protein gel system | Life Technologies (Invitrogen) | |
| Kodak Gel Logic 112 | Carestream Health, Inc | |
| Kodak camera assembly | Carestream Health, Inc | |
| Consumables | ||
| Name | Company | Catalog Number |
| XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 100850-001 |
| 100867-100 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich Co | 221473 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Acros | 12421-0010 |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Lonza | 17-512F |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P333 |
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich Co | M7506 |
| ATP | Sigma-Aldrich Co | A9187 |
| Fatty acid-free BSA | Calbiochem | 126575 |
| Sucrose | Sigma-Aldrich Co | S0389 |
| Bacterial proteinase | Sigma-Aldrich Co | P-8038 |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich Co | M9546 |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich Co | M9272 |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3784 |
| EGTA | Sigma-Aldrich Co | E3889 |
| BCA protein assay kit | Sigma-Aldrich Co | PI23227 |
| Succinic Acid* | Sigma-Aldrich Co | S3674 |
| Pyruvic acid* | Sigma-Aldrich Co | P5280 |
| Malic acid* | Sigma-Aldrich Co | 2288 |
| ADP(K+ salt)* | Sigma-Aldrich Co | A5285 |
| XF Cell mito stress test kit | Seahorse Biosciences | 101706 |
| Tween-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-29113 |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gel | Life Technologies (Invitrogen) | NP0343BOX |
| Immobilin Transfer Membranes (0.45um) | Millipore | IPVH20200 |
| MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml | Life Technologies (Invitrogen) | NP0001 |
| NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter | Life Technologies (Invitrogen) | NP0006-1 |
| Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) | Abcam | ab14734 |
| Primary antibodies (mAB to GAPDH) | Abcam | ab9484 |
| Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF822E001EA |
| Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF812E001EA |
| *ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only | ||
参考文献
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).
- Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods. 26, 292-297 (2002).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2011).
- Iglesias-Gonzalez, J., Sanchez-Iglesias, S., Beiras-Iglesias, A., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E. A simple method for isolating rat brain mitochondria with high metabolic activity: effects of EDTA and EGTA. Journal of Neuroscience Methods. 213, 39-42 (2013).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418, 213-223 (2011).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PloS One. 8, e82392 (2013).
- Chappell, J. B., Perry, S. V. The respiratory and adenosinetriphosphatase activities of skeletal-muscle mitochondria. The Biochemical Journal. 55, 586-595 (1953).
- Tyrrell, D. J., et al. Respirometric Profiling of Muscle Mitochondria and Blood Cells Are Associated With Differences in Gait Speed Among Community-Dwelling Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. , (2014).
- Nicklas, B. J., et al. Relationship of physical function to vastus lateralis capillary density and metabolic enzyme activity in elderly men and women. Aging Clinical and Experimental Research. 20, 302-309 (2008).
- Bergstrom, J. Percutaneous needle biopsy of skeletal muscle in physiological and clinical research. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 35, 609-616 (1975).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6, e21746 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PloS One. 6, e18317 (2011).
