Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

OPMERKING: De beschreven werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van Wake Forest School of Medicine protocol. Geïnformeerde toestemming werd verkregen schriftelijk. Alle deelnemers waren gezonde oudere volwassenen (65-79 jaar) van beide geslachten, met BMIs variërend 23-35. 1. Skeletal spierbiopsie Zoals eerder beschreven, 9 voer alle biopsies in de vroege ochtend na een O / N fast. Vraag de onderwerpen afzien van aspirine, recept en over-the-counter niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen of andere verbindingen die bloeden, bloedplaatjes of kneuzingen kunnen beïnvloeden de week voor de biopsie. Vraag de deelnemers om ook onthouden van elke inspannende activiteit voor ten minste 36 uur voorafgaand aan de biopsie. OPMERKING: Spier verkregen uit de vastus lateralis met de percutane naald biopsie techniek een percutane naald onder plaatselijke verdoving met 1% lidocaïne. Geen medische complicaties of other gemelde bijwerkingen van de procedure hebben voorgedaan in onze klinische onderzoekseenheid. Opmerking: De beschreven biopsie procedure wordt aangepast van die van Bergstrom 10. In het kort, lokaal toe te dienen 1% lidocaïne verzorgen de spieren niet te infiltreren. Volg deze met een 10 minuten wachttijd om voldoende verdoving toe. Neem de biopten uit de buik van de spier (de middelste gebied van de spier tussen het inbrengen en herkomst) vermijden subfascial en myotendonous gebieden. Gebruik percutane naald (een zuig bijgestaan ​​herbruikbare apparaat met een kant snijden raam en innerlijke snijden cilinder) en volgen een fasciaal "pop" of weerstand van de fascia als een gids. Schat de diepte van de anesthesie naald, dan weer het gevoel dat het met de smalle scalpel en maak een 4-5 mm incisie door de fascia. Vooraf de naald door de incisie totdat deze in de spier geplaatst. Verzamelenmeerdere monsters met het raam gedraaid in verschillende richtingen. Solliciteer continue zuigkracht met een 60 cc spuit en bevordert tegelijk of intrekking van spieren monsters in de percutane naald twee tot vier keer in verschillende richtingen. Staak de zuig- en verwijder de naald. OPMERKING: Elke pas (inbrengen en verwijderen van de naald) dient minder dan een minuut duren. Laat een helper van toepassing stevige druk op de bouwplaats te doorboren voor 5 min tot hemostase te vestigen. Koppel naald uit zuig slangen en verwijder voorzichtig de spieren monsters uit het raam en vat. Maak een tweede pas als er meer spieren nodig is door het proces te herhalen. Verwijder alle zichtbare bloedstolsels van de spier monster met behulp van een tang, weegt het monster, en meteen plaatsen in een buisje met ijskoude DPBS. OPMERKING: De gemiddelde opbrengst met behulp van deze methode is 150 ± 20 mg. 2. Mitochondriale Isolatie <ol> Vers bereiden Chappel-Perry (CP) en mitochondriale testoplossing (MAS) buffers (tabel 1) op de dag van het experiment of monster en bewaar ze bij -20 ° C. Bereid de verbindingen in dimethylsulfoxide in een concentratie van 2,5 mM en de hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C. Gebruik de buffer en samengestelde monsters bewaard bij -20 ° C binnen de 2 maanden na de dag van de voorbereiding. Verwijder zichtbare bindweefsel van het monster met behulp van een scherpe schaar en pincet; indien nodig gebruik een dissectie microscoop voor deze stap. Grondig te wassen exemplaren 3-4 keer met ijskoude DPBS buffer om bloed te verwijderen. Houd de monsters op ijskoude DPBS en het proces zo snel mogelijk, het verzorgen meer dan 45 min van biopsie niet te overschrijden. Neem voorzorgsmaatregelen om elk pezen of vetweefsel verwijder voorzichtig uit de spier monster. Onmiddellijk Hak de spierweefsel in fijne stukjes met een steriele schaar en schorten in 500 pi tot 1 ml CPI met proteinase (Nagarse) bij een concentratie van 0,2 mg / g weefsel. Volg deze met een 5 min incubatie bij kamertemperatuur en vervolgens transfer naar het ijs. Homogeniseer gehakt weefsel behandeld met Nagarse een geautomatiseerd homogenisator. Houd het monster op het ijs in dit hele proces. Homogeniseer elk weefselmonster vier keer, telkens met een puls van 2 sec, de geautomatiseerde homogenisator bij een snelheid van 10.000 rpm. Was de sonde met 70% ethanol en vervolgens met gedestilleerd water tussen de weefsels. Was het gehomogeniseerde weefsel met een gelijk volume CP I (500 ui 1 ml) en 2x volume CP II (1 ml tot 2 ml), en de inhoud in een centrifugebuis en centrifugeer verzamelen bij 600 xg, 4 ° C 10 min. Passeren de bovenstaande vloeistof op een bevochtigd kaasdoek, het eluaat en gooi de pellet, waardoor het verwijderen van de meerderheid van de niet-mitochondriale fracties. 3. Het wassen van de mitochondriën Centrifugeer het supernatant van de bovenstaande stap 10,000 xg, 4 ° C gedurende 10 min. Suspendeer de pellet in 4 ml CP II buffer en verder centrifugeer bij 10.000 xg, 4 ° C gedurende 10 min. LET OP: In zeldzame gevallen wordt een dunne pellet van bloed onder de mitochondriale pellet gevormd. In dat geval verwijdert u de mitochondriale pellet door behoedzame aspiratie met CPII buffer. Deze stap kan worden vermeden door grondig te wassen weg bloed bij stap 2. Hang de pellet verkregen in 2 ml van CP I buffer. In dit stadium gebruik maken van een kleine hoeveelheid van deze suspensie voor eiwit schatting. Resuspendeer de resterende monster in CP I buffer en centrifuge zoals hierboven. Suspendeer de uiteindelijke pellet in een minimale hoeveelheid (200 ui) van Mitochondriale testoplossing (MAS). OPMERKING: Eiwit wordt getest in dit stadium omdat CP-buffer geen BSA, terwijl MAS waarbij de monsters later opgeschort heeft BSA in. 4. Schatting van de mitochondriale inhoud van meten eiwitconcentratie met een BCA Protein Assay Kit <pclass = "jove_content"> NB: Met deze concentratie de hoeveelheid mitochondriën voor het laden berekend op een 24-well microplaat voor respirometrische metingen of Western blot experimenten. Rekening houden met de verdunningsfactor (10) voor de berekening van de eiwitconcentratie. 5. Voer de XF testen zoals beschreven door Rogers, GW, et al. 12 OPMERKING: Visualiseer de O 2 verbruik (OCR) in pMol O 2 / min, of absolute niveaus van O 2 en pH in de data-uitgang. Gebruik 1x MAS bereiden van verbindingen te injecteren. Voeg een 10x concentratie van de verbindingen om de poorten AD een eindconcentratie als volgt: poort A, ADP [Adenosine 5'-diphosphate, 2 mM, 50 gl]; poort B, oligomycin (2 uM, 55 pl); poort C, FCCP [carbonyl cyanide 4- (trifluormethoxy) fenylhydrazon, 6 uM, 60 gl]; en poort D, 2 uM antimycin-A (65 pl). Bereidenvoldoende volume van verbindingen voor het vereiste aantal putten. Bepaal de optimale hoeveelheid mitochondria door titratie. Bijvoorbeeld, lading 1,0 ug, 2,5 ug en 5,0 ug mitochondriën per putje in een 50 pl volume ijskoude 1x MAS substraat. De variabiliteit tussen de putten te minimaliseren, eerst verdunnen 10x mitochondriën in koud 1x MAS + substraat. Vervolgens leveren 50 ul van deze suspensie aan elk putje (behalve de achtergrond correctie putten). Centrifugeer de plaat bij 2000 xg, 20 min bij 4 ° C. Na centrifugeren zachtjes voeg 450 ul van 1 x MAS + succinaat (10 mM) en rotenon (2 uM) (beginwaarden; zie hieronder) aan elk putje. Bekijk de mitochondriën onder de microscoop om homogene naleving van de put voordat ervoor te zorgen dat de overdracht van de plaat om de XF analyser. OPMERKING: De beginwaarden zal afhangen of de ademhaling wordt aangedreven door ofwel ETC complex I of complex II. Voor complexe-II gedreven ademhaling, gebruik succinate (10 mm) en rotenon (2 uM) als initiële condities. Rotenon blokken complex I en succinaat voorziet brandstof voor complexe II (succinaat dehydrogenase). Ademhaling aangedreven door complexe I studie Gebruik een pyruvaat en malaat, elk bij een eindconcentratie van 5 mM of glutamaat en malaat elk bij een eindconcentratie van 10 mM als beginwaarden. De laatste kan helpen bij het onderscheiden van disfunctie onder citroenzuurcyclus en transport substraat. Ademhaling gedreven door zowel complex I en complexe II studie, onder meer pyruvaat en succinaat zonder rotenon of malaat als beginvoorwaarden. Gebruik palmitoyl carnitine als substraat voor β-oxidatie. Sequentieel meet de mitochondriale ademhaling in real time via de respirometer door het programmeren van het zoals eerder beschreven 12. Gebruik de instellingen voor de respirometer in Tabel 2. OPMERKING: Een korte uitleg van de verschillende mitochondriale ademhaling toestanden zijn: <li> State 2 = gekoppelde toestand met substraat aanwezig; State 3 = fosforyleren ademhaling in aanwezigheid van verzadigende ADP; Staat 4 o = niet-fosforylerende ademhaling veroorzaakt door oligomycin; Staat 3u = maximale ontkoppeld ademhaling gestimuleerd door de ontkoppelrail FCCP; Resterend niet-mitochondriale ademhaling = respiratie van complex III remming door antimycin-A. Voorts zij opgemerkt dat de lengte van de OCR meting in combinatie met de mitochondriale concentratie de gegevens door uitputting zuurstof tijdens de meetperioden kunnen beïnvloeden. 6. Western Blot OPMERKING: Bepaal de mitochondriale marker COX IV en hele weefsel GAPDH- door Western blotting aan verrijking van de mitochondriën te verzekeren in de uiteindelijke steekproef Scheid de geïsoleerde mitochondria en hele weefsel extract met 12% natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gels. Overdracht van de eiwitten op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan. Incubeer met COX IV antilichaam (1: 20.000), gevolgd door mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde secundaire antilichamen. Voor GAPDH- vastberadenheid, strip de vlek en sonde met een GAPDH monoklonaal antilichaam (1: 2.000). OPMERKING: Als de verschillen in ER verontreiniging van belang zijn, zijn onder andere ER markers zoals ERp72, calnexin, of calreticuline in de analyse.