线粒体的制备及透气性评估，从骨骼肌组织通过穿刺活检获得的分离

注：说明是经医学维克森林学校的机构审查委员会的协议。以书面形式获得知情同意书。所有与会者都健康老年男女的成年人（65-79岁），身体质量指数从23-35。 1.骨骼肌活检如前所述，9后的O / N高速执行清晨的所有活组织切片检查。询问受试者服用阿司匹林，处方药和非处方非甾体抗炎药，或其他化合物可能影响出血，血小板，或瘀伤的一周前的活检来避免。请参与者也从任何剧烈活动为避免前活检至少36小时。 注：肌肉是从股外侧采用与1％利多卡因局部麻醉下经皮针的穿刺活检技术获得。无并发症或o疗法报道从过程的不良事件都发生在我们的临床研究单位。 注：所描述的活检过程是改编自该伯格斯特龙10。 简单地说，本地管理1％利多卡因注意不要渗入肌肉。用10分钟的等待时间按照此允许足够的麻木。 取活检从肌肉（插入和原点之间的肌肉的中间区域）避免筋膜和myotendonous区的腹中。 利用经皮针（侧切割窗口，内切汽缸吸入可重复使用的辅助装置），并跟随筋膜“啪”的招牌作为指导或阻力。 估计的深度与麻醉针，然后再次感觉到它与窄手术刀刀片和通过筋膜进行4-5毫米切口。通过切口推进针，直到它被插入到肌肉。 收集与窗口多个样品转向不同的方向。使用60毫升注射器而进退肌肉样品进经皮针两到四倍以不同方向施加连续吸力。中止吸并取出针。 注：每个通（插入和拔出针）花费时间不超过一分钟。 有一个助手适用于公司的压力，穿刺部位5分钟建立止血。从吸气管拔掉针头，小心地从窗口桶取出的肌肉样本。 使第二通如果更多的肌肉，需要通过重复上述过程。 使用镊子除去从肌肉样品的可见的血块，称重样品，并立即在含有冰冷的DPBS的管放置。 注：使用这​​种方法的平均产量为150±20毫克。 2.线粒体隔离 <OL> 新鲜制备Chappel-佩里（CP）和线粒体测定溶液（MAS）的缓冲器（ 表1）在实验中，或等分的一天，并将其存储在-20℃。制备在二甲基亚砜中的化合物为2.5毫米的浓度和等分并储存在-20℃。使用储存在-20℃下2个月内从作成日的缓冲液和化合物等分试样。 删除使用锋利的剪刀和镊子样品可见结缔组织;如果需要的话用解剖显微镜对这一步骤。彻底洗净标本3-4次，用冰冷的DPBS缓冲以除去血液。保持在冰冷的DPBS和过程中的样品，尽快，注意不要超过从活检超过45分钟。采取预防措施，以小心地从肌肉样本中删除任何肌腱或脂肪组织。 立即用无菌剪刀印章的肌肉组织成细片，并在500微升暂停含公关1毫升CPIoteinase（枯草菌），在0.2毫克/克组织的浓度。用5分钟在室温下孵育遵循这一点，然后转移到冰上。 均质使用自动均质与枯草菌处理的碎组织。请在此过程中冰的样本。均质每个组织样本4次，每次时间为2秒的脉冲，使用自动匀浆在10,000 rpm的速度设置。洗探针，用70％的乙醇，随后通过组织之间的蒸馏水。 与CP I（500微升至1毫升）和CPⅡ的2倍体积（1ml至2ml）中的等体积的洗匀浆组织，并在600×g离心，4℃收集在一个离心管中，离心分离机的内容10分钟。通过湿纱布传递上清液，收集滤液弃沉淀，从而消除了大多数非线粒体分数。 3.洗涤的线粒体从上述步骤离心上清液10，000×g离心，4℃，10分钟。暂停在4ml的CP二缓冲器，并进一步离心沉淀以10,000×g离心，4℃，10分钟。 注：在极少数情况下，薄血颗粒形成如下线粒体沉淀。在这种情况下，通过温和抽吸与CPII缓冲器移除线粒体沉淀。可避免彻底洗去血液在步骤2本步骤。 暂停的CP I缓冲2毫升得到的粒料。在这个阶段使用一个小的等分试样，从该悬浮液中蛋白质的估计。重悬的其余样品中的CP I缓冲液和离心如上。暂停在线粒体测定溶液（MAS）的最小量（200微升）的最终的沉淀。 注：蛋白质测定是在这个阶段，因为CP I缓冲区没有BSA，而MAS其中样本将被暂停后确实有BSA在里面。 4.评估线粒体含量测定蛋白质浓度用BCA蛋白检测试剂盒<p类=“jove_content”>注：使用此浓度来计算用于装载线粒体的量到24孔微孔板进行呼吸计测量，或用于蛋白质印迹实验。考虑到稀释因素（10），用于蛋白质浓度的计算。 5.所描述的罗杰斯，GW 等执行XF检测。12 注：可视化的O 2消耗率（OCR）在皮摩尔O 2 /分钟，或O 2，pH值在数据输出绝对水平。 使用1倍的MAS以制备化合物被注入。添加10倍浓度的化合物的端口的AD，得到的最终浓度如下：端口A，ADP [腺苷5'二磷酸，2mM的50微升]; B端口，寡霉素（2μM，55微升）;端口C，FCCP [羰基氰4-（三氟甲氧基）苯腙，6微米，60微升]和端口D，2μM抗霉素A（65微升）。准备足够的体积为孔的所需数量的化合物。 通过滴定测定线粒体的最佳量。例如，负载1.0微克，2.5微克和5.0微克的含基材冰冷1X MAS 50微升体积每孔线粒体。为了尽量减少井之间变化，第一稀释10倍的线粒体在寒冷的1个MAS +基板。接着，提供50微升此悬浮液到每个孔中（除了背景校正孔）。 离心板在2000×g离心，20分钟，在4℃。离心后，轻轻地加入450微升1×MAS +琥珀酸盐（10毫摩尔）和鱼藤酮（2μM）（初始条件;见下文），以每孔中。查看在显微镜下的线粒体，以确保均匀的遵守现有井到板转移到XF分析器。 注意：用于将依赖于由任一ETC复合物I或复合体II的呼吸是否被驱动的初始条件。对于复杂II驱动的呼吸，用succinate（10毫米）和鱼藤酮（2μM）作为初始条件。鱼藤酮块复合物I和琥珀提供燃料复合物II（琥珀酸脱氢酶）。来研究呼吸由复合物I驱动，使用丙酮酸和苹果酸盐，各为5毫米或谷氨酸和苹果酸盐的每个的终浓度为10 mM的终浓度为初始条件。后者可以帮助区分之间的三羧酸循环和基板的运输功能障碍。为了研究通过呼吸既复杂我和复杂II驱动，包括丙酮酸和琥珀酸无鱼藤酮或苹果酸作为初始条件。使用棕榈酰肉毒碱作为底物为β氧化。 使用呼吸通过编程它如先前描述的12顺序地实时测量的线粒体呼吸。使用设置为表2中提供的呼吸。 注：不同的线粒体呼吸状态的简要说明如下： <li>国2 =与基板结合目前的状态;国家3 =在ADP饱和的存在磷酸呼吸;国家4 O =非磷酸化呼吸诱导寡;国家3U =最大的​​解偶联呼吸作用的解偶联剂FCCP刺激;经过复杂的III抑制抗霉素-A的剩余非线粒体呼吸呼吸=。还应当指出的是，OCR测量的组合长度与线粒体浓度可以通过在测量期间消耗氧气影响的数据。 6.免疫印迹注：由Western印迹确定线粒体标记COX IV和整个组织GAPDH保证线粒体富集的最终样品中分离的分离的线粒体，整个组织提取物由12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶。 蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。孵育COX IV抗体（1：20000），其次是辣根过氧化物酶（HRP）缀合的二抗。对于GAPDH的决心，剥离印迹和探针与GAPDH单克隆抗体（1：2000）。 注：如果在ER污染差异是令人关注的，包括ER标志物如ERp72，钙联接蛋白，钙网蛋白或在分析中。