概要

实时电:采用闭环协议来探测神经动力学和超越

Published: June 24, 2015
doi:

概要

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Abstract

实验神经学正在经历的发展和应用新颖的和往往是复杂的,闭环协议,其中的刺激施加实时取决于系统的响应的兴趣增加。最近的应用范围从虚拟现实系统的实施为研究运动 ​​反应无论是在小鼠12斑马鱼,以控制使用以下3光遗传学皮质中风发作。闭环技术的关键优点在于,探测更高维属性不能直接访问或依赖于多个变量,如神经元兴奋4和可靠性,而在同一时间最大化实验吞吐量的能力。在这方面的贡献,并在细胞电的情况下,我们将描述如何各种闭环协议适用于锥体皮层神经元,REC响应特性的研究在从幼年大鼠躯体感觉皮层急性脑片膜片钳技术orded细胞内。由于没有市售或开源软件提供了所有必需的用于高效执行这里所描述的实验的特征,开发了一种新的软件工具箱称为LCG 5,其模块化结构最大化的计算机代码的重用,并且容易实现新的实验范例的实施。刺激波形使用的是紧凑元说明中指定和完整实验方案在基于文本的配置文件中描述。此外,LCG具有适合于反复试验和实验规程自动化的命令行界面。

Introduction

近年来,细胞电已从在电压和电流钳实验采用现代闭环协议传统的开环模式演变而来。最有名的闭环技术也许是动态钳6,7,这使合成注射人工电压门控离子通道,以确定神经元膜电压8中的非确定性闪烁的影响的深入研究离子通道在神经反应动力学9,以及娱乐现实体外接近体内的突触背景活动10。

已经提出的其它闭环范例包括反应性夹具11,以研究在体外自我维持的持久性活动的生成,并且响应夹紧4,12,调查细胞机制底层神经元兴奋。

内容】“>这里,我们描述了允许应用各种闭环电协议中的急性脑切片进行全细胞膜片钳记录的上下文中,功能强大的框架。我们将展示如何通过膜片钳记录装置来记录体膜电压从幼年大鼠的躯体感觉皮层和锥体神经元使用申请LCG,在理论和神经生物学的神经工程实验室开发的一个命令行的软件工具箱三种不同的闭环协议。

简要地,所描述的协议中,首先在自动注射的一系列电流钳刺激波,相关的一大组有源和无源膜性能的表征。这些已被建议来捕获的细胞的电生理学表型在其响应性质方面至刻板一系列刺激波形。称为小区的电子代码例如 ,参见  13,14),电反应这样的集合所使用的几个实验室的它们的电学性能的基础上,以客观地分类的神经元。这包括在固定输入输出传递关系(FI曲线),通过创新的技术,包括通过一个比例 – 积分 – 微分(PID)控制器的装置触发速率的闭环,实时控制的分析的,现实的体内样背景突触活动的第二体外制剂10和,由虚拟GABA能interneuron,这是由计算机模拟的装置在两个同时记录锥体细胞的实时第三人工连接的娱乐。

此外,LCG实现了被称为活跃的补偿电极(AEC)15,它允许使用实现单电极钳动态协议技术。这使得补偿的不良影响(一当它被用于输送细胞内的刺激出现的记录电极的rtifacts)。该方法是基于在记录电路的等效电特性的非参数估计。

在本文中描述的技术和实验方案可以在常规开环电压和电流钳实验可容易地提供,并且可以延伸到其他制剂,如胞外4,16或细胞内记录体内 17,18。设置为全细胞膜片钳电的精心组装是稳定的,高品质的录音非常重要的一步。在下文中,我们假设这样一个实验装置已经提供给实验者,和我们的注意力集中于描述LCG的使用。请读者指出,19-22关于优化和调试的其他提示。

Protocol

这里描述的协议符合的建议和安特卫普大学生物医学科学系的伦理委员会的指导方针。此协议需要从幼年大鼠的移出脑,由批准人道的安乐死技术得到的制剂的非有情材料。 1,设备的准备安装和配置数据采集和激励机制。 使用配有由喜剧作家支持的数据采集(DAQ)卡的个人计算机(PC)的记录信号和模拟控制电压发送到电放大器。 注:喜剧作家是一个Linux…

Representative Results

在前面的章节中,我们已经描述了如何使用该软件工具箱LCG表征L5锥体细胞的电生理特性和重新体内样突触活性的切片准备。使用命令行界面和半自动化协议的有利于实验,这可能对所产生的数据的输出和质量有很大的影响的再现性和效率。另外,由于数据被保存在一个一致的方式,很容易扩展分析,以一个特定的目标。 图1示出了一个实验,其中使用六个不同的协议的小区的?…

Discussion

在该文本的完整协议的实时实施,闭环单细胞电生理实验进行了说明,使用膜片钳技术和最近开发的软件工具箱称为LCG。要优化录音的质量是至关重要的录音设置正确接地,屏蔽和无振动:这可确保稳定持久的全细胞进入细胞,这与自动化的刺激方案整个路段的可能性在一起允许对实验的吞吐量最大化。

两种情况,即LCG可以应用已经提出,一个单元的即在其电生理特性( <str…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.

Materials

Tissue slicer Leica VT-1000S
Pipette puller Sutter P-97
Pipettes WPI 1B150F-4 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament
Vibration isolation table TMC 20 Series
Microscope Leica DMLFS 40X Immersion Objective
Manipulators Scientifica PatchStar
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B Computer controlled
Data acquisition card National Instruments PCI-6229 Supported by Comedi Linux Drivers
Desktop computer Dell Optiplex 7010 Tower OS: real-time Linux
Oscilloscopes Tektronix TDS-1002
Perfusion Pump Gibson MINIPULS3 Used with R4 Pump head (F117606)
Temperature controller Multichannel Systems TC02 PH01 Perfusion Cannula
Manometer Testo 510 Optional
Incubator Memmert WB14
NaCl Sigma 71376 ACSF
KCl Sigma P9541 ACSF, ICS
NaH2PO4 Sigma S3139 ACSF
NaHCO3 Sigma S6014 ACSF
CaCl2 Sigma C1016 ACSF
MgCl2 Sigma M8266 ACSF
Glucose Sigma G7528 ACSF
K-Gluconate Sigma G4500 ICS
HEPES Sigma H3375 ICS
Mg-ATP Sigma A9187 ICS
Na2-GTP Sigma 51120 ICS
Na2-Phosphocreatine Sigma P7936 ICS

参考文献

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記事を引用
Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond. J. Vis. Exp. (100), e52320, doi:10.3791/52320 (2015).

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