The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.
Protein sentezi Düzenleme strese hücre yanıt olarak önemli bir kontrol noktasını temsil eder. Özellikle, gizli RNA, düzenleyici elemanlar tipik olarak belirli bir stres tepkisi için gerekli olan proteinler için kodlayan spesifik mRNA, seçici çeviri izin vermek için gösterilmiştir. Bu mRNA'lardan yanı sıra seçici çeviri sorumlu düzenleyici mekanizmaların karakterizasyonu Kimlik süredir moleküler biyoloji ön planda olmuştur. Polizom profilleme bu çalışmalarda bir dönüm yöntemdir. Polizom profil amacı, farklı kopyalar üzerinde aktif çeviri ribozomlar immobilize edilmesi ile mRNA dönüşümüyle yakalamak ve bu yüzden de çok tercüme transkript ve kötü tercüme olanlar arasında bir ayrım sağlayan, bir sükroz gradyanı üzerinde ultra-santrifüj ile elde edilen poliribozomların ayırmaktır. Bu daha sonra, klasik biyokimyasal ve moleküler biyoloji yöntemleri ile ayırt edilebilir. Önemli bir şekilde, birleştirme syüksek kapasiteli genomik yaklaşımları ile olysome profil öteleme düzenlemenin bir büyük ölçekli analizi sağlar.
Protein sentezi (translasyon) düzenlenmesi, iyice hücre hayatta kalma ile bağlantılı önemli bir hücresel süreçtir. Çeviri hücrenin enerji% 50'sinden fazlasını tüketir göz önüne alındığında, bu çeviri sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ki ve çeviri tedirginlikler iyi tolere edilmez olması şaşırtıcı değildir. Tersine, bir çok sapkın hücresel süreçlerle nakil mekanizması ve çeviri çıkış (yani proteom) değiştirilmek üzere olmasını gerektirir. Bu genellikle, çeşitli stres cevabı ve hastalık durumlarında da olduğu, ve muhtemelen en iyi kanser örneklenmiştir. Translasyon kontrolünde önemli bir avantajı, hızlıca, çeşitli iç ve dış tetikleyicilere karşılık olarak protein çıkışı yeniden programlamak hücrelerin yeteneği, ve böylece ince ayar mekanizması olduğunu şunun hücre yaşamı ve ölümüyle 1 arasındaki denge.
Öteleme kontrolü iki yönü özellikle ilginçtir; düzenleyici mec doğa anlayışıilk yerde seçici çeviri ortaya, özel tetikle idare hücresel yanıt olarak katılmak hanism (ler) ve kontrol belli bir çeviri izin elemanları, ve spesifik mRNA tespiti ve bunların protein ürünleri. Polizom profil Her iki yöntemin etkin çalışma sağlayan bir tekniktir.
Polizom profil tekniğinin genel amacı eğitim ve farklı hücresel şartlar altında belirli mRNA'lann çeviri durumunu ölçmek için. Tekniğin temel ilkesi, böylece, bir sükroz gradyanı üzerinde ultra-santrifüj ile elde edilen poliribozomların 'dondurulması farklı kopyalar üzerinde aktif çeviri ribozomlar ve ayrı' (birkaç ribozom bağlayıcı) son derece çevrilmiş transkriptler arasında bir ayrım için izin vererek mRNA dönüşümüyle yakalamak için kötü (bir veya iki ribozomlar bağlı) olanlar çevrilmiştir. Bu özel protokol, antibiyotik sikloheksimidin bağlandığım60S ribozomal alt birim ve bloklar ribozom E sitesinden 2 deasetillenmiş tRNA serbest, ribozom translokasyon inhibe ve çeviri mRNA üzerinde ribozomlar durak için kullanılır. Ancak, aynı zamanda blok yapıldı uzama 3, kullanılabilirler, örneğin, emetin gibi bloke edici maddeler.
Western blotting ve çeviri işleminin son çıkış ölçmek 35S-metionin etiketleme teknikleri farklı olarak, bu nedenle, farklı koşullar altında mekanizmalarından ilişkin daha ayrıntılı bir çalışma için izin veren, profil aktif çevrilmemiş mRNA ile ribozom ilişki ölçüm avantajına sahiptir polisom. Bu yüzden, tekniği kolayca özel çeviri 4-6 farklı modlar incelemek için adapte edilebilir, protein faktörleri çeviri düzenleme, 7-9, protein sentezini 1,10,11 ya da üst baş yangınlar ya da mRNA yapıları etkilerini etkileyen, gerilimli şartlar yer Protein synth açık okuma çerçeveleriagenezis 12-14. Günümüzde, polisom profil uygulama daha geniş polisomlann ilişkili mRNA'ları analiz etmek için, DNA mikrodizilerinin 15 ya da yeni nesil dizileme 16,17 kullanımı ile bulunmaktadır.
Polysomal profil farklı tedavi koşulları altında belirli transkript çeviri devletin ölçümü için olanak sağlayan güçlü bir tekniktir. Prensip çok basit bir tekniktir ama iyi Polizom profilleri üretmek için kritik bazıları yürütme birkaç adımları gerektirir. 1) RNazsız kimyasallar ve plastik malzeme kullanılarak, 2) (iyi sakaroz geçişlerini hazırlamak bizim deneyim% 10-50 sakaroz geçişlerini verimli bağlı ribozomlarla 40 / 60S alt birimleri ve mRNA'lan) çözümlemek için en iyi iş, ve 3: Bu tuş adımlar ) en yüksek çeviri oranlarını yakalamak için katlanarak büyüyen hücreleri ve fazla% 80 konfluent kullanarak. Bu tür gen demonte veya aşırı ekspresyonuna sürece hücre tedavileri, yaparken plaka hücre miktarı hücreler son ucunda birleştirilebilmeli ne kadar bir fonksiyonu olacaktır, böylece bu ikinci aşaması dikkate alınmalıdır.
Sonuçlarda Konusuted burada, Polizom profili analizi IRES'e-barındıran mRNAlar XIAP ve Bcl-xL 12 çeviri düzenlenmesinde PDCD4 rol değerlendirmek için önemli bir araç oldu. Biz PDCD4 knock-down (Şekil 1B) üzerine genel Polizom profillerinde herhangi bir değişiklik dikkat etmedi aslında bize PDCD4 deney koşullarında küresel hücresel çeviri zarar vermedi sonucuna izin verdi. Önümüzdeki PDCD4 veya kontrol siRNA'lara ile tedavi hücrelerde XIAP ve Bcl-xL mRNA'ların dağılımını belirlemek için RT-qPCR analizi kullanılmıştır. Bu mRNA'nın dağılımının niceliksel yerine Yarı-nicel analiz için ve tedaviler arasında çeviri verimliliği ince değişimlerin saptanması için sağlar, çünkü QPCR, standart RT-PCR veya Northern Blot karşıt olarak, polisom profilleri analiz için tercih edilen bir yöntemdir. Bu tekniği kullanarak, XIAP ve Bcl-xL mRNA'ların dağılımı (gr edilen toplam hedef mRNA'nın bir yüzdesi olarak ifade edilen bu gösterebilmişlerdiradient) belirgin ve böylece, bu mRNA çevirisinde bir artışla, PDCD4 knock-down (Şekil 1D, e) bunlarla ilişkili ribozom çok sayıda) ağır poliribozomların (mRNA içine kaydırılmıştır. Bu da XIAP ve Bcl-xL protein düzeyinde değil, bunların kararlı durum RNA düzeyi (Şekil 1F, G), bir artış ile teyit edilmiştir. Önemli bir şekilde, XIAP olmayan IRES varyantının polisom dağılımı tedavi edilen ve edilmeyen hücreleri (Şekil 1C) arasında aynı idi. Seçenek olarak ise, dönüşüm etkinliğini 14 (genellikle 2-4 fraksiyonlar) monosomes karşı polizom mRNA içeriği olan bir oranda (genellikle 5-10 fraksiyon) olarak sunulabilir.
254 nm absorbans okuma gözlenen zirveleri kendi ribozomal RNA (deterjan isnat edilemez olarak protokol boyunca kontrolleri kullanımı sonucu profilleme herhangi Polizom doğrulayarak önemlidirörneğin Triton X-100 gibi ler, kuvvetli) spektrumun bu bölgede absorbe ve gradyan üstündeki 40 / 60S tepe gizleyebilir. Lisatı olmayan ve / veya lisat tamponu ile Boş gradyanı, 254 nm'de abzorbans, tamponlar nispi katkısının belirlenmesi için çalıştırılması gerekir. Artefactual yüksek mertebeden yapılar da aslında hiçbiri (örneğin "sözde Polisomlar" 20) vardır polizom hatalı yorumlara yol açabilir. Magnezyum Ayrılan iki değerlikli katyon kenetleme maddesi EDTA (80S ribozomlar stabilize etmek için işlem boyunca kullanılan) büyük (60S bileşen küçük (40S) içine ribozom ayrılmasına neden olacaktır lizatlarına ve gradyan tamponu (15 dakika için 20 mM) eklendi ) alt birimi. 260 nm'de kaydedilen absorbans pikleri polisomlann gerçekten de Dolayısıyla, eğer EDTA muamelesiyle tek bir maksimum mRNA ve ribozomal birimleri serbest tekabül gradyanının üst kısmında görülen edilecek şekilde profili çökecek (veriler gösterilmemiştir). RastlayanProfilin EDTA kaynaklı çökmesiyle birlikte, qPCR analiz belirli hedeflerin hepsi şimdi degrade üstünde bulunmalıdır.
Bir mRNA ile ilişkili ribozomların sayısı her zaman belirli bir mRNA tercüme ediliyor nasıl verimli bir göstergesi değildir. Nitekim, polisomlar aktif çeviri okuyucu farkında olmalıdır 21,22 durdu hale geldiği özel bağlamları vardır. Transkript aktif EDTA aksine, 'run-off' aktif bir mRNA boyunca translocating olan ribozomların neden Puromycin ile örnek, tedavi) bir tarafından yapılabilir çeviri makine ile meşgul, veya b) örnek tedavisi olsun ya da olmasın belirlenmesi Yine herhangi bir aşağı translokasyon Ribozomların 'run-off' neden başlangıç kodonu sadece ilk ribozomun translokasyonu inhibe homoharringtonin'le.
QPCR analizi için kontrol transkriptleri kullanılması da önemlidir. SelecBu tür XIAP IRES olmayan IRES varyant bazı temizlik genin (GAPDH, aktin, tubulin, Nucleolin), ribozomal mRNA (18S, RPL13A) halinde ya da bu durumda, farklı tedavi koşullarında etkilenmez transkript tion, önemlidir doğrulama çeviri üzerinde tedavinin etkisinin spesifik ya da genel olup olmadığını. Bu kontrol transkriptleri burada yapılan gibi analiz mRNA'ların dağılımını normalize etmek için kullanılabilir (XIAP ve Bcl-xL mRNA'lar, GAPDH mRNA için normalize edildi ve her fraksiyon mRNA içeriğinin toplamı ile temsil edilen toplam mRNA'nın içeriğinin yüzdesi olarak ifade edildi ) ya da seçenek olarak, hedef ve kontrol mRNA'lar, mutlak değerler olarak ifade edilen ve ayrı olarak gösterilebilir. giriş lizatlan (toplam hacmi genellikle,% 10) olarak QPCR analizi belirli mRNA'ların dağıtımı için kontrol edecek bir adımdır. İdeal olarak, giriş lizat belirli transkriptin mRNA içeriği analiz 10 fraksiyonları mRNA muhtevası toplamının ile karşılaştırılabilir nitelikte olmalıdır. NihayetBir isteğe bağlı aşama fenol kontrol etmek için: kloroform ile ekstre etme aşaması (kedi, kloramfenikol asetil transferaz gibi) ardından qPCR sayısal olarak ve hatta kullanılabilir normalleştirmek için bir in vitro transkribe raportör mRNA ile her polisom fraksiyonu başak etmektir Veriler 14.
Herhangi bir teknik olduğu gibi, polisom profil bazı sınırlamalar sunulur. Genellikle 10 kesirler bir asgari güzel Polizom dağılımları olması için toplanması gerekmektedir (çeviri verimliliğinde daha ince kaymalar 20 veya daha fazla gerekebilir) olması bu adımı 4 örneklerinin sadece maksimum olabilir anlamda, sınırlayıcı yapar Bir anda analiz rahat bir kerede RNA ekstraksiyon ve 40 örnekleri ve 4 giriş kontrolleri QPCR analizini idare edebilmek için. Örneklem büyüklüğü kolayca QPCR yapmak çoğaltır kaç transkript analiz edilecek ve kaç ile ekleyebilirsiniz, ve bu pahalıya mal olabilir. QPCR tabanlı polysomal profil a diğer kısıtlılığınalysis sadece (transkript önceden bilinen analiz edilmesi) ve çeviri genom analizi için tatbik edilemez bir aday temelli yaklaşım yapılabilir olmasıdır. Ancak, 21. yüzyılın başında, araştırmacılar DNA kullanılarak bir genomik düzeyde polysomal RNA sorguya başladı nesil dizileme 16,17 ile daha yakın zamanda 15 ve mikroarray'ler. Daha çok ayrı ayrı fraksiyonların QPCR analizi yapan daha haricinde bu protokolde tarif edildiği gibi, bu güçlü bir yaklaşım olarak, polysomal profil gerçekleştirilir, genel çeviri kısımlar (genellikle fraksiyon 2-4) ve polizom parçacıklar (genellikle kısımlar) toplanır ve varyasyonları analiz monosomes DNA mikro-dizisi ya da tüm genom RNA sekansları vasıtası ile. Dolayısıyla bu yaklaşım ile, bu değerlendirmek mümkündür tüm olan dağıtım kaymalar polisomlar dan monosomes için (çeviri azalma) ya da tam tersi (çeviri artış) belirli bir tedavi üzerine mRNAlarment. Belirli mRNA Polisomlar dağıtım Doğrulama ve miktar sonra qPCR yapılabilir. Polysomal profil ilkesinin daha da güçlü kullanım ribozom profillemesidir. Bu tekniğin daha yüksek verimlilik uzatma Polizom fraksiyonların 23 yüzlerce eşzamanlı izleme sağlayan son zamanlarda bildirildi. Mutant koleksiyonları veya büyük ölçekli RNAi ekranlarında öteleme verimliliği sondalama Bu açık bir avantaj sağlamaktadır. Ribozom profil protein sentezinde 24,25 yapan ribozomlar (ribozom ayak) tarafından korunan RNA parçaları eşleştirmek için yeni nesil dizileme yararlanır bir tekniktir. Bu teknikte, ribozom translokasyon sikloheksimid (geçici) ya da emetin (geri dönüşümsüz) bir ribozom ayak izi bir popülasyonunu üretmek üzere hücre lizizi ve RNaz sindirimi ile başlık ile inhibe edilebilir. Ribozomlar, zenginleştirilmiş total RNA izole edilir ve kirletici ribozomal ve mitokondriyal ribozomal RNA çıkarılır.Yaklaşık 26-28 nükleotid RNA ayak izi izole bir cDNA kütüphanesine dönüştürülmüştür, transkripsiyonu ve 26 dizilenmiştir ters. Standart Polizom profilleme aksine, bu yaklaşım sadece translationally düzenlenir belirli mRNA'lan tanımlayan değil aynı zamanda belirli bir transkript boyunca tam işgal ve ribozomların yoğunluğu gibi kodon çözünürlükte mRNA özgü bilgileri verir. O nerede oluştuğunu transkript ribozom-istihdamına hakkında daha fazla bilgi verebilir Bu, özellikle, bu tür IRES-yataklık mRNA'lanmn gibi çeviri özel modları ile mRNA'larL için ilginçtir.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14×89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |