הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל
概要
The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.
Abstract
רגולציה של סינתזת חלבון מהווה נקודת שליטה מרכזית בתגובה תאית ללחץ. בפרט, יחידות בקרת RNA דיסקרטי הוצגו כדי לאפשר לתרגום סלקטיבי של mRNAs הספציפי, אשר בדרך כלל קשורים לחלבונים הנדרשים לתגובת לחץ מסוימת. זיהוי של mRNAs אלה, כמו גם האפיון של מנגנוני פיקוח אחראים לתרגום סלקטיבי היה בחוד החנית של ביולוגיה מולקולרית לכמה זמן. פרופיל Polysome הוא שיטת אבן פינה במחקרים אלה. המטרה של פרופיל polysome היא ללכוד תרגום mRNA על ידי משתק ריבוזומים פעיל תרגום בתמלילים שונים ונפרדת polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשר להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר ואלה תורגמו בצורה גרועה. אז יכולות להיות מאופיינות אלה נוספות על ידי שיטות ביולוגיה מולקולריות ביוכימי ומסורתית. חשוב לציין, עמ 'שילובolysome פרופיל עם גישות הגנומי תפוקה גבוהה מאפשר ניתוח בקנה מידה גדול של הרגולציה translational.
Introduction
רגולציה של סינתזת חלבון (תרגום) היא תהליך תאי חשוב שקשורה קשר הדוק להישרדות סלולרית. בהתחשב בעובדה שהתרגום צורך יותר מ -50% מהאנרגיה של התא, אין זה מפתיע שהתרגום מוסדר בחוזקה ושההפרעות בתרגום אינן נסבלות היטב. לעומת זאת, רבים תהליכים תאיים חריגים דורשים כי מכונות תרגום ופלט תרגום (כלומר proteome) צריכים להיות שונה. זה קורה לעתים קרובות במדינות תגובת לחץ ומחלות שונות, והוא כנראה הכי טוב שהודגם בסרטן. יתרון מפתח של שליטת translational הוא היכולת של תאים לתכנת מחדש במהירות את תפוקת החלבון בתגובה לטריגרים חיצוניים ופנימיים שונים, מנגנון כוונון ובכך בסדר שעצות האיזון בין הישרדות תא ומות 1.
שני היבטים של שליטת translational מעניינים במיוחד; הבנה של הטבע של MEC הרגולציהאלמנטי hanism (ים) ובקרה המאפשרים לתרגום ספציפי, וזיהוי של mRNAs הספציפי ומוצרי החלבון שלהם, המשתתפים בתגובה התאית להדק המסוים שעורר תרגום סלקטיבי במקום הראשון. פרופיל Polysome הוא טכניקה המאפשרת לימוד אפקטיבי של שני התהליכים.
המטרה הכללית של טכניקת פרופיל polysome היא ללמוד ולכמת את מצב התרגום של mRNAs המסוים בתנאים סלולריים שונים. העיקרון של השיטה הוא ללכוד תרגום mRNA על ידי '' הקפאה '' ריבוזומים פעילים תרגום בתמלילים שונים ונפרדים polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשרים להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר (מחויבת כמה ריבוזומים) ו גרוע מתורגם אלה (כפופים לריבוזומים אחד או שניים). בפרוטוקול ספציפי זה, cycloheximide האנטיביוטי שנקשר ל60S מקטע ריבוזומלי וחוסם את שחרורו של tRNA deacetylated מאתר E הריבוזום 2, משמש כדי לעכב טרנסלוקציה הריבוזום ולעכב ריבוזומים על mRNAs תרגום. עם זאת, סוכני חסימה אחרים כגון emetine שתרגום גם חוסם התארכות 3, ניתן להשתמש.
בניגוד למערבי סופג ו -35 S-מתיונין טכניקות תיוג המודדות את התוצר הסופי של תהליך התרגום, polysome יש פרופיל את היתרון של מדידת עמותת ריבוזומים עם mRNAs באופן פעיל-המתורגם, ובכך מאפשר למחקר מפורט יותר של מנגנוני תרגום בתנאים שונים. לפיכך, הטכניקה ניתן להתאים בקלות ללמוד במיוחד מצבים שונים של תרגום 4-6, גורמי חלבונים מעורבים בויסות תרגום 7-9, תנאי לחץ משפיעים על סינתזת חלבון 1,10,11 או את ההשפעות של מבני mRNA כגון IRES או במעלה הזרם מסגרות קריאה פתוחות בסינטיסייזר החלבוןesis 12-14. כיום, polysome יישומי פרופיל הם אפילו רחבים יותר בשימוש במערכים DNA 15 או רצף של הדור הבא 16,17 לנתח mRNAs הקשורים polysomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרופיל Polysomal הוא טכניקה רבת עוצמה שמאפשרת כימות של מדינת תרגום של תמלילים מסוימים בתנאי טיפול שונים. זוהי טכניקה פשוטה מאוד באופן עקרוני ובכל זאת דורשת מספר שלבים של ביצוע, שחלקם הם קריטיים לייצור פרופילי polysome טובים. שלבים העיקריים אלה הם: 1) שימוש בכימיקלים וplasticware RNase חינם, 2) הכנה הדרגתיים סוכרוז טוב (הדרגתיים סוכרוז 10-50% בניסיון שלנו עובדים הכי טוב עבור יעילות פתרון 40 / 60S יחידות משנה וmRNAs עם ריבוזומים קשורים), ו- 3 ) תוך שימוש בתאים שגדלים באופן אקספוננציאלי ולא מחובר יותר מ -80% על מנת ללכוד את השיעור הגבוה ביותר של תרגום. צעד אחרון זה צריך להילקח בחשבון כאשר עושים טיפולי תא ארוכים, כגון מציאה גן או ביטוי יתר, כך שהסכום של תאים לצלחת יהיה פונקציה של כמה התאים יהיו מחוברים בנקודת הסיום.
בתוצאות presenטד כאן, polysome ניתוח הפרופיל היה כלי חשוב להערכת תפקיד PDCD4 בויסות התרגום של mRNAs XIAP וBcl-XL 12-מחסה IRES. העובדה שאנו לא צופים כל שינוי בפרופילי polysome הכלליים על PDCD4 לדפוק למטה (איור 1) אפשרה לנו להגיע למסקנה כי PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי בתנאים של הניסוי. אנחנו הבאים עשינו שימוש בניתוח RT-qPCR כדי לקבוע את חלוקת XIAP וBcl-XL mRNAs בתאים שטופלו עם PDCD4 או siRNAs שליטה. qPCR הוא שיטת בחירה של ניתוח פרופילי polysome, בניגוד לסטנדרטי RT-PCR או סופג צפון, משום שהוא מאפשר ללא כמו ניתוח חצי כמותית של הפצת mRNA ולגילוי שינויים דקים בtranslational יעילות בין טיפולים. השימוש בטכניקה זו, הצלחנו להראות כי ההפצה של mRNAs Bcl-XL XIAP ו( כאחוז מכלל mRNA היעד על פני גרadient) היה עבר בצורה משמעותית לpolyribosomes הכבד (mRNAs עם מספר גדול של ריבוזומים הקשורים בם) לאחר PDCD4 לדפוק למטה (1D איור, E), וכך מצביעה על עלייה בתרגום של mRNAs אלה. זה אושר גם על ידי עלייה ברמות חלבון XIAP וBcl-XL אבל לא ברמות RNA המצב היציב שלהם (איור 1F, G). חשוב לציין, הפצת polysome של הגרסה הלא-IRES של XIAP הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג '). לחלופין, יעילות translational יכולה להיות מוצגת כיחס בין תוכן mRNA בpolysomes (בדרך כלל שברי 5 עד 10) לעומת monosomes (בדרך כלל שברים 2 עד 4) 14.
השימוש בבקרות בכל הפרוטוקול חשוב באימות כל polysome פרופיל תוצאה, כפי שניתן לא בכוחות עצמם לייחס פסגות שנצפו מקריאות ספיגה ב 254 ננומטר ל- RNA ריבוזומלי (חומר ניקוישל, כגון טריטון X-100 מאוד לספוג באזור זה של הספקטרום ועלול לטשטש 40 / 60S פסגות בחלק העליון של השיפוע). מילויים ריקים ללא lysate ו / או עם חיץ lysate צריכים להפעיל כדי לקבוע את תרומתו היחסית של המאגרים לספיגה ב 254 ננומטר. Artefactual מבנים מסדר גבוהים יותר גם יכולים להוביל לפרשנות מוטעה של polysomes שבו יש באף עובדה (לדוגמא "פסאודו-polysomes" 20). Sequestering מגנזיום (המשמש בכל ההליך כדי לייצב 80S ריבוזומים) עם EDTA chelator קטיון דו הערכי הוסיף לlysates ולמאגר שהשיפוע (20 מ"מ במשך 15 דקות) יגרום הפרדה של הריבוזום לקטן (40S) המרכיב אותה וגדול (60S תת-יחידות). לכן, אם פסגות ספיגה נרשמו ב 260 ננומטר הן אכן polysomes, טיפול EDTA יקרוס הפרופיל כזה שמקסימום יחיד יהיה שנצפה בחלק העליון של שיפוע המתאים לשחרור ה- mRNA ויחידות ריבוזומלי (מידע לא מוצג). ביחדעם קריסה מושרה EDTA של הפרופיל, כל המטרות הספציפיות נותחו על ידי qPCR צריך להימצא כעת בחלק העליון של השיפוע.
מספר ריבוזומים הקשורים mRNA הוא לא תמיד אינדיקציה למידת היעילות שmRNA מסוים מתורגם. ואכן, יש הקשרים ספציפיים שבו תרגום פעיל בpolysomes הופך תקוע 21,22 שהקורא צריך להיות מודע. קביעה אם או לא תמלילים עוסקים באופן פעיל עם מכונות התרגום יכולים להיעשות על ידי) טיפול במדגם עם puromycin, שלא כמו EDTA, גורם ל'ניגר 'של ריבוזומים שבאופן פעיל translocating פני mRNA, או ב) טיפול במדגם עם homoharringtonine אשר מעכב טרנסלוקציה של הריבוזום הראשון רק בקודון ההתחלה, שוב גורם ל'ניגר 'של כל ריבוזומים translocating במורד הזרם.
השימוש בתמלילי שליטה לניתוח qPCR הוא גם קריטי. אין התמיכה בבחירהtion של תמלילים שאינם מושפעים מהתנאים טיפול שונים, כגון גנים מסוימים במשק בית (GAPDH, אקטין, טובולין, Nucleolin), mRNAs ריבוזומלי (18S, RPL13A) או במקרה זה גרסה הלא-IRES של IRES XIAP, הוא חשוב ב האימות אם ההשפעה של הטיפול על תרגום היא ספציפית או כללי. תמלילי שליטה אלה יכולים לשמש כדי לנרמל את ההפצה של mRNAs ניתח כפי שנעשה כאן (mRNAs XIAP וBcl-XL היה מנורמל GAPDH mRNA ומבוטא באחוזים מכלל תוכן mRNA המיוצגים בסכום של תוכן mRNA בכל שבריר ) או לחלופין, יכול לבוא לידי ביטוי mRNAs היעד והשליטה כערכים מוחלטים ומוצג בנפרד. ניתוח qPCR של lysates הקלט (בדרך כלל 10% מנפח כולל) הוא צעד נוסף שישלוט על חלוקת mRNAs הספציפי. באופן אידיאלי, תוכן mRNA של תמליל ספציפי בlysate הקלט צריך להיות דומה לסכום של תוכן mRNA בכל 10 הברים ניתחו. לבסוף, צעד אופציונאלי לשליטה לפנול: שלב חילוץ כלורופורם הוא ספייק כל חלק polysome עם במבחנה mRNA כתב עיבד (כגון CAT, אצטיל כלורמפניקול transferase) שניתן לכמת בהמשך על ידי qPCR ויכול גם לשמש כדי לנרמל 14 נתונים.
כמו בכל טכניקה, פרופיל polysome מציג כמה מגבלות. העובדה שבדרך כלל מינימום של 10 שברים (משמרות עדינות יותר ביעילות תרגום עשויה לדרוש יותר או 20) צריכה להיות שנאספו על מנת לקבל הפצות polysome נחמדה עושה את הצעד הזה הגבלה, במובן זה שרק למקסימום של 4 דגימות יכול להיות ניתח בכל פעם כדי שתוכל לטפל בנוחות מיצוי RNA וניתוח qPCR של 40 דגימות ובקרת 4 קלט בבת אחת. גודל המדגם יכול בקלות להוסיף עם כמה תמלילים להיות מנותחים וכמה qPCR משכפל לעשות, וזה יכול להיות יקר. מגבלה נוספת של פרופיל polysomal מבוסס qPCRnalysis הוא שזה יכול להיעשות רק על גישה מבוססת מועמד (שבו התמלילים להיות מנותחות ידועים מראש) ולא יכולים להיות מיושמים לניתוח הגנום של תרגום. עם זאת, בתחילת המאה ה -21, חוקרים החלו לחקור RNA polysomal שלהם ברמה גנומית באמצעות DNA microarrays 15 ולאחרונה עם רצף של הדור הבא 16,17. בגישה זו עוצמה, פרופיל polysomal מתבצע כפי שתואר בפרוטוקול זה אלא שבמקום לבצע ניתוח qPCR של שברים בודדים, monosomes שברים (בדרך כלל חלק 2-4) וpolysomes שברים (בדרך כלל שברים) הם אספו יחד ושינויים בתרגום העולמי נתח על ידי מערך DNA או RNA רצף הגנום. מכאן עם גישה זו, ניתן להעריך את כל mRNAs הפצה שמשמרות מpolysomes לmonosomes (ירידה בתרגום) או להיפך (עלייה בתרגום) על טיפול ספציפיment. אימות וכימות הפצת polysomes mRNA ספציפית אז יכולים להיעשות על ידי qPCR. שימוש אפילו יותר חזק של עיקרון פרופיל polysomal הוא פרופיל הריבוזום. הארכת תפוקה גבוהה נוספת של טכניקה זו דווחה לאחרונה, המאפשרת ניטור בו-זמני של מאות polysome שברים 23. זה מספק יתרון ברור כאשר חיטוט יעילות translational של אוספי מוטציה או במסכי RNAi בקנה מידה גדולה. פרופיל הריבוזום הוא טכניקה שמנצלת רצף של הדור הבא למפה שברי RNA מוגנים על ידי ריבוזומים (עקבות הריבוזום) העוסקים בסינתזה של חלבוני 24,25. בטכניקה זו, טרנסלוקציה הריבוזום יכולה להיות מעוכבת עם cycloheximide (הפיך) או emetine (בלתי הפיך) ואחריו תמוגה תא ועיכול RNase להניב אוכלוסייה של עקבות הריבוזום. הריבוזומים מועשרים, RNA הכולל מבודד, וריבוזומלי זיהום וRNA ריבוזומלי המיטוכונדריה מוסר.עקבות RNA של כ 26-28 נוקלאוטידים מבודדות, הפוך עיבד, הפך לספריית cDNA והרצף 26. בניגוד לפרופיל polysome סטנדרטי, גישה זו לא רק מזהה mRNAs הספציפי שמוסדרים translationally אלא גם מניבה מידע mRNA הספציפי ברזולוציה קודון כגון כיבוש המדויק וצפיפות של ריבוזומים לאורך תמליל ספציפי. זה מעניין בעיקר לmRNAs עם מצבים ספציפיים של תרגום כגון mRNAs IRES-מחסה, כפי שהוא יכול לתת מידע נוסף על מיקום בהריבוזומים לגיוס התמליל מתרחש.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
| Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
| WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14×89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
| Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
| Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
| Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
| MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
| Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
| RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |
参考文献
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
- Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
- Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5’TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
- Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
- Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
- Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
- Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
- Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
- Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
- Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
- Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
- Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5′ UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
- Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
- Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
