3-D-Bildgebung und Analyse von Neuronen Infizierte<em> In-vivo-</em> Mit<em> Toxoplasma gondii</em
概要
Unter Verwendung dieses Protokolls konnten wir Bild 160 um dicke Gehirnschnitte von Mäusen mit dem Parasiten Toxoplasma gondii, der Visualisierung und Analyse der räumlichen Beziehung zwischen dem encysting Parasiten und der infizierten Neuronen ermöglicht infiziert.
Abstract
Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazelluläre Parasiten mit einem breiten Wirtsbereich, einschließlich des Menschen und Nagetieren. Bei Mensch und Nager, stellt Toxoplasma eine lebenslange persistierende Infektion im Gehirn. Während dieses Gehirn-Infektion ist asymptomatisch in den meisten immunkompetenten Personen, in den sich entwickelnden Fötus oder immungeschwächten Personen wie das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) Patienten, diese Vorliebe für und Persistenz im Gehirn können zu verheerenden neurologischen Krankheit führen. Somit ist es klar, dass die Hirn Toxoplasma-Wechselwirkung ist für die durch Toxoplasma hergestellt symptomatischen Erkrankungen, doch wir haben wenig Verständnis der zellulären oder molekularen Interaktion zwischen Zellen des Zentralnervensystems (ZNS) und den Parasiten. Im Mausmodell von ZNS-Toxoplasmose es seit über 30 Jahren, die Neurone sind die Zellen, in denen der Parasit besteht bekannt, aber wenig bekannt ist über dieTeil des Neurons wird in der Regel infiziert (Soma, Dendriten, Axonen) und wenn das Mobil Beziehung ändert sich zwischen den Stämmen. Teilweise ist dieses Fehlen Sekundär der Schwierigkeit Bildgebung und Visualisierung ganzen infizierten Neuronen aus einem Tier. Solche Bilder würde typischerweise erfordern Serienschnitt und Heften von Gewebe durch Elektronenmikroskopie oder konfokale Mikroskopie nach Immunfärbung abgebildet. Durch die Kombination mehrerer Methoden, die hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Verwendung von dicken Abschnitten (160 um) zu erkennen und Bild ganze Zellen, Zysten enthält, so dass eine dreidimensionale Visualisierung und Analyse von einzelnen, chronisch infizierten Neuronen ohne Immunofärbung Elektronenmikroskopie oder Serienschnitt und Nähen. Mit dieser Technik können wir damit beginnen, die zelluläre Beziehung zwischen dem Parasiten und den infizierten Neuronen zu verstehen.
Introduction
Das Gesamtziel dieses Verfahrens ist, eine hohe Auflösung, dreidimensionale Bilder von einzelnen Neuronen, die durch die obligate intrazelluläre Parasiten Toxoplasma gondii infiziert werden erhalten.
Toxoplasma wird oft als eines der erfolgreichsten Parasiten wegen seiner großen Zwischenwirtsspektrum, die Menschen und Nagetieren umfasst. Bei Mensch und Nager, nach einer akuten Infektion durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln oder Wasser, ist Toxoplasma der Lage, eine anhaltende Infektion des ZNS durch Umwandlung von seiner schnellen replizierenden Form (der Tachyzoiten) seiner langsamen replizieren und encysting Form führen (die bradyzoite ). Bei immunkompetenten Personen wird dieses latente ZNS-Infektion gedacht relativ asymptomatisch zu sein, aber bei immungeschwächten Personen wie AIDS-Patienten oder Transplantatempfängern, kann Wiederaufleben des Parasiten zu tödlichen Toxoplasma-Enzephalitis 1,2 führen. Darüber hinaus neuere Studien hahabe gezeigt, dass eine latente Infektion mit Toxoplasma kann zu Verhaltensänderungen bei Nagern 3,4 führen, obwohl der Mechanismus ist unbekannt.
Überraschenderweise trotz dieser Daten unterstreichen die Bedeutung des ZNS Toxoplasma Interaktion, ist relativ wenig über diese Beziehung bekannt, vor allem auf zellulärer und molekularer Ebene. Die Fähigkeit, selbst einfache Aspekte der Gehirnparasit Interaktion zu studieren, wurde teilweise durch technologische Einschränkungen behindert. Beispielsweise kann der Großteil der Arbeit, die die Nervenzellen sind die Zellen, in denen Zysten bestehen mit der Elektronenmikroskopie (EM) 5,6 geschehen. Obwohl EM bietet hohe Auflösung, es ist zeitaufwendig, arbeitsintensiv und teuer. Immunfluoreszenz (IF) -Assays wurden kürzlich im Zusammenhang mit der konfokalen Mikroskopie verwendet worden, um die Arbeit von EM 7 getan bestätigen. IF Assays sind technisch leicht durchzuführen und relativ preiswert, aber die Verwendung dieser Techniken zu Untermaßtand die räumliche Beziehung zwischen der Zyste und der infizierten Nervenzelle erfordert Serien Rekonstruktion, die zeitaufwendig, technisch schwierig ist, und können zum Verlust der wertvollen Informationen führen. Daher haben wir eine Methode, die mit dem Mausmodell der Toxoplasmose ZNS verwendet werden können und ermöglicht es uns, Bild die Gesamtheit der infizierten Nervenzellen ohne EM oder Immunhistochemie (IHC) entwickelt. Durch die Entwicklung einer solchen Technik, können wir beginnen, die zelluläre Beziehung zwischen der infizierten Zelle und der Zyste in einem relativ schnelle und kostengünstige Art und Weise zu erkunden.
Die Methode, die wir entwickelt verbindet neuere Techniken zur optischen Clearing- und Abbildungs dicke Gehirnschnitte durch konfokale Mikroskopie 8 mit einem System, das in vivo Zellen, die mit Parasiten Proteine 9,10 injiziert wurden markiert. In diesem System zu infizieren wir Cre-Reportermäusen, die ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren nur nach Cre-vermittelte Rekombination 11 mit Toxoplasma </em> Stämme, die ein rot fluoreszierendes Protein (RFP) zum Ausdruck bringen und injizieren Cre-Rekombinase in Wirtszellen 9. Diese Kombination ermöglicht es uns, die infizierte Mäusehirn ernten nach ZNS-Infektion festgestellt, schneiden dicke Gehirnschnitte und schnell zu identifizieren relevante Bereiche für Bild durch Auffinden der RFP + Zysten. Es ist wichtig zu beachten, daß als Wirtszelle die Expression von GFP, hängt ausschließlich von der Injektion von Cre durch Parasiten und nicht auf eine Infektion, eine Anzahl der GFP + -Zellen keine Parasiten 10 enthalten. Da das Ziel dieses Protokolls ist es, in der Lage, Bild gesamten infizierten Nervenzellen sein, ist der Fokus nur auf GFP + Neuronen, die auch ein RFP + Zyste enthalten, aber das Protokoll kann auch für Bild verwendet werden, die das GFP + / RFP – Neuronen.
Sobald der infizierten Gehirn geerntet und geschnitten werden die Abschnitte transparent durch Glycerin Clearing gerendert. Geeignete Bereiche der Abschnitte werden dann mit Konfokalmikroskopie al abzubildendengenden beispiellose Visualisierung der infizierten Wirtszellen und den eingekapselten Parasiten in ihrer Gesamtheit. Hier bieten wir Ihnen ein komplettes Protokoll zur Identifizierung, optisch Clearing-und Imaging-infizierten Nervenzellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da die zellulären Veränderungen in infizierten Wirtszellen haben, um Krankheitsverläufe bei Infektionen mit anderen intrazellulären Organismen wie HIV, Tollwut und Chlamydia 18,19 in Verbindung gebracht worden, eine Technik, die es uns ermöglichen, die intimen Interaktionen, die zwischen dem ZNS auftreten Studie entwickelten wir Wirtszelle und Toxoplasma. Das hier beschriebene Verfahren erreicht dieses Ziel durch eine effiziente Abbildung von chronisch infizierten Neuronen. Vor der Entwicklung d…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem gesamten Koshy für die Diskussionen. Wir danken Patty Jansma und die University of Arizona Neuroscience Institut für Beratung und Hilfe bei der Bildgebung. Wir danken auch den Porreca Labor für die Nutzung ihrer Vibratom. Diese Forschung wurde von der US National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK) unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| 200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
参考文献
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