Imagerie 3-D et de l'analyse des neurones infecté<em> In Vivo</em> Avec<em> Toxoplasma gondii</em

L'objectif global de cette méthode est d'obtenir des images haute résolution en trois dimensions de neurones individuels qui sont infectés par le parasite intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii.

Toxoplasma est souvent considéré comme l'un des parasites les plus réussies en raison de sa large gamme de hôte intermédiaire, qui comprend les humains et les rongeurs. Chez les humains et les rongeurs, après l'infection aiguë par ingestion d'aliments ou d'eau contaminés, Toxoplasma est capable de provoquer une infection persistante du SNC par la conversion de sa forme de réplication rapide (la tachyzoïte) à sa lente réplication et enkyster forme (l'bradyzoïte ). Chez les individus immunocompétents, cette infection latente CNS est pensé pour être relativement asymptomatiques, mais chez les personnes immunodéprimées comme les sidéens ou les receveurs de greffe, la recrudescence du parasite peut conduire à toxoplasmose cérébrale fatale ^1,2. En outre, des études récentes have montré que l'infection latente par Toxoplasma peut conduire à des changements de comportement chez les rongeurs ^3,4, bien que le mécanisme reste inconnu.

Étonnamment, malgré ces données soulignant l'importance de l'interaction CNS- Toxoplasma, on sait relativement peu de cette relation, en particulier au niveau cellulaire et moléculaire. La possibilité d'étudier les aspects même les plus simples de l'interaction cerveau-parasite a été entravée en partie par des limitations technologiques. Par exemple, la majeure partie du travail montre que les neurones sont les cellules dans lesquelles persistent kystes a été fait avec la microscopie électronique (EM) ^5,6. Bien EM donne haute résolution, il est temps, de main-d'œuvre, et coûteux. Immunofluorescence (IF) les essais ont été récemment utilisé en conjonction avec la microscopie confocale pour confirmer le travail effectué par EM ^7. Si les analyses sont techniquement facile à réaliser et relativement peu coûteux, mais l'utilisation de ces techniques pour undertand la relation spatiale entre le kyste et le neurone infecté nécessite la reconstruction de série, qui prend du temps, techniquement difficile, et peut conduire à la perte d'informations précieuses. Ainsi, nous avons développé une méthode qui peut être utilisé avec le modèle murin de la CNS toxoplasmose et nous permet de l'image l'ensemble des neurones infectés sans EM ou immunohistochimie (IHC). En développant une telle technique, nous pouvons commencer à explorer la relation cellulaire entre la cellule infectée et le kyste d'une manière relativement rapide et peu coûteuse.

Le procédé que nous avons développé combine les techniques actuellement disponibles pour la compensation optique et des coupes de cerveau épaisseur d'imagerie par microscopie confocale à ⁸ avec un système qui marque dans les cellules in vivo qui ont été injectées avec des protéines parasitaires ^9,10. Dans ce système, on infecte les souris Cre-rapporteurs qui expriment une protéine fluorescente verte (GFP) qu'après la recombinaison médiée par Cre ¹¹ par Toxoplasma </em> Souches qui expriment une protéine fluorescente rouge (RFP) et se injectent la recombinase Cre dans les cellules hôtes ^9. Cette combinaison nous permet de récolter le cerveau de souris infectée après l'infection du système nerveux central est établi, couper des sections de cerveau épais, et identifier rapidement les domaines pertinents pour l'image en trouvant la DP ⁺ kystes. Il est important de noter que l'expression de la cellule hôte de la GFP dépend uniquement de l'injection de Cre par des parasites, et non sur l'infection, un certain nombre de cellules GFP ⁺ ne contiennent pas de parasites ^10. Comme l'objectif de ce protocole est de pouvoir neurones infectés images entières, l'accent est mis uniquement sur ​​la GFP ⁺ neurones qui contiennent également un appel d'offres ⁺ kyste, mais le protocole peut également être utilisé pour l'image de la GFP ⁺ / DP ^– neurones.

Une fois que le cerveau infecté est récolté et sectionnée, les sections sont rendus transparents par compensation glycérol. Régions appropriées des articles sont ensuite visualisés en microscopie confocale, alci-visualisation sans précédent de cellules hôtes infectées et les parasites enkystés dans leur intégralité. Ici, nous fournissons un protocole complet pour identifier, de compensation optiquement, et les neurones d'imagerie infectés.