3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected<em> In Vivo</em> Met<em> Toxoplasma gondii</em

Het algemene doel van deze methode is in een hoge resolutie, drie-dimensionale beelden van individuele neuronen die zijn geïnfecteerd met het obligate intracellulaire parasiet Toxoplasma gondii verkrijgen.

Toxoplasma wordt vaak beschouwd als een van de meest succesvolle parasieten vanwege zijn grote tussengastheer serie, die mensen en knaagdieren bevat. Bij zowel mensen en knaagdieren, na acute infectie door het eten van besmet voedsel of water, Toxoplasma is in staat om een persistente infectie van het CZS veroorzaakt door het omzetten van zijn snelle replicerende vorm (de tachyzoite) om de trage-vermeerderingsfase encysting vorm (de bradyzoite ). In immuuncompetente individuen, wordt dit latente CNS infectie gedacht relatief asymptomatisch zijn, maar in immuungecompromitteerde personen zoals AIDS patiënten of ontvangers, kan weer uitbreken van de parasiet tot fatale encefalitis toxoplasmic ^1,2. Daarnaast recente studies have aangetoond dat latente infectie met Toxoplasma kan leiden tot gedragsveranderingen bij knaagdieren ^3,4, hoewel het mechanisme blijft onbekend.

Verrassend, ondanks deze gegevens benadrukken het belang van het CNS- Toxoplasma interactie, relatief weinig bekend is over deze relatie, in het bijzonder op cellulair en moleculair niveau. De mogelijkheid om zelfs eenvoudige aspecten van de interactie hersenen-parasiet bestuderen is deels belemmerd door technologische beperkingen. Bijvoorbeeld, het merendeel van het werk blijkt dat neuronen de cellen waarin cysten blijven is gedaan met elektronenmicroscopie (EM) ^5,6. Hoewel EM geeft hoge resolutie, het is tijdrovend, arbeidsintensief en duur. Immunofluorescentie (IF) assays zijn onlangs gebruikt in combinatie met confocale microscopie met het werk van EM ⁷ bevestigen. IF testen zijn technisch eenvoudig uit te voeren en relatief goedkoop, maar met behulp van deze technieken understand de ruimtelijke relatie tussen de cyste en de besmette neuron vereist seriële reconstructie, dat is tijdrovend, technisch moeilijk, en kan leiden tot verlies van waardevolle informatie. Aldus hebben we een methode die kan worden gebruikt met het muismodel van CNS toxoplasmose en laat ons beeld de gehele geïnfecteerde neuronen zonder EM of immunohistochemie (IHC) ontwikkeld. Door het ontwikkelen van een dergelijke techniek, kunnen we beginnen de cellulaire relatie tussen de geïnfecteerde cel en de cyste in een relatief snelle en goedkope wijze verkennen.

De methode die we ontwikkeld combineert nieuwere technieken voor het optisch clearing en imaging dikke hersensecties door confocale microscopie ⁸ met een systeem dat markeert in vivo cellen die zijn ingespoten met parasiet eiwitten ^9,10. In dit systeem infecteren we Cre-reporter muizen die een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie na Cre gemedieerde recombinatie ¹¹ met Toxoplasma </em> Stammen die een rood fluorescerend eiwit (RFP) te uiten en te injecteren Cre recombinase in gastheercellen ^9. Deze combinatie stelt ons in staat om de geïnfecteerde muizenhersenen oogsten na CNS infectie is vastgesteld, snijd dikke hersenen secties, en snel te identificeren relevante gebieden om het beeld door het vinden van de RFP ⁺ cysten. Het is belangrijk op te merken dat als gastheercel expressie van GFP alleen afhankelijk injectie van Cre door parasieten, en niet op infectie, een aantal GFP ⁺ cellen niet parasieten ¹⁰ bevatten. Als het doel van dit protocol is om te kunnen het hele geïnfecteerde neuronen, de focus is alleen op GFP ⁺ neuronen die ook een RFP ⁺ cyste bevatten, maar het protocol kan ook worden gebruikt voor het imago van de GFP ⁺ / RFP ^– neuronen.

Zodra de besmette hersenen wordt geoogst en gesegmenteerd, worden de secties transparant gemaakt door glycerol clearing. Geschikte gebieden van de secties worden vervolgens afgebeeld met confocale microscopie, algende ongekende visualisatie van geïnfecteerde gastheercellen en de ingekapselde parasieten in hun geheel. Hier bieden we een compleet protocol voor het identificeren, optisch clearing, en imaging geïnfecteerde neuronen.