3-D изображений и анализ нейронов Infected<em> В Vivo</em> С<em> Токсоплазма</em

Основная цель данного метода является получение высокого разрешения, трехмерные изображения отдельных нейронов, которые заражены облигатной внутриклеточным паразитом Toxoplasma Gondii.

Toxoplasma часто считается одним из самых успешных паразитов из-за его большой промежуточной области хоста, которое включает в себя людей и грызунов. В обоих людей и грызунов, после острой инфекции при проглатывании зараженной пищи или воды, Toxoplasma может привести к хронической инфекции ЦНС путем преобразования из его форму быстрого дуплицируемый (в tachyzoite) в его медленном тиражирования и encysting форму (bradyzoite ). В иммунокомпетентных лиц, это латентное инфекции ЦНС, как полагают, чтобы быть относительно бессимптомно, но в индивидуумов с ослабленным иммунитетом, таких как больных СПИДом или реципиентов, рецидив паразита может привести к фатальной toxoplasmic энцефалита ^1,2. Кроме того, недавние исследования гаве показали, что скрытая инфекция с токсоплазмозом может привести к поведенческим изменениям у грызунов ^3,4, хотя механизм остается неизвестным.

Удивительно, но, несмотря на эти данные, подчеркнув важность взаимодействия CNS- Toxoplasma, относительно мало известно об этом отношений, особенно на клеточном и молекулярном уровне. Способность к обучению даже простые аспекты мозговой паразит взаимодействия была затруднена в части технологических ограничений. Например, большинство работы, показывающие, что нейроны клетки, в которой сохраняются кисты было сделано с электронной микроскопии (ЭМ) ^5,6. Хотя EM дает высокое разрешение, это занимает много времени, трудоемкий, и дорого. Иммунофлуоресценции (ИФ) анализы недавно были использованы в сочетании с конфокальной микроскопии, чтобы подтвердить проделанную EM ^7. Если анализы технически легко выполнить и относительно недороги, но при использовании этих методов, чтобы UndersТ и пространственное соотношение между кистой и инфицированных нейрона требуется серийный реконструкцию, которая занимает много времени, технически сложно, и может привести к потере ценной информации. Таким образом, мы разработали метод, который может быть использован с мышиной модели ЦНС токсоплазмоза и позволяет изображению полноту инфицированных нейронов без их или иммуногистохимии (IHC). Развивая такую ​​технику, мы можем начать изучение клеточного отношения между инфицированной клетки и кисты относительно быстро и недорогим способом.

Метод, который мы разработали сочетает в себе новые технологии для оптически очистки и толстых срезов головного мозга визуализации с помощью конфокальной микроскопии ⁸ с системой, которая отмечает в естественных условиях клетки, которые были введены с паразитов белков ^9,10. В этой системе, мы заражают Cre-репортер мышей, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) только после того, как Cre-опосредованного рекомбинации ¹¹ с Toxoplasma </em> Штаммы, которые выражают красный флуоресцентный белок (RFP) и инъекционные Cre рекомбиназу в клетках-хозяевах ^9. Это сочетание позволяет нам использовать зараженный мозг мыши после инфекции ЦНС установлено, вырезать толстые срезы головного мозга, и быстро идентифицировать соответствующие области, чтобы изображение путем нахождения RFP ⁺ кисты. Важно отметить, что, как клетка-хозяин выражение GFP зависит только от инъекции Cre паразитами, а не на инфекции, количество GFP ⁺ клеток не содержат паразитов ^10. Поскольку целью данного протокола является, чтобы иметь возможность изображения целых инфицированных нейронов, в центре внимания находится только на GFP ⁺ нейронов, которые также содержат ППП ⁺ кисту, но протокол также может быть использован для изображения GFP ⁺ / RFP ^– нейроны.

После того, как зараженный мозг собирают и срезы, срезы оказываются прозрачным глицерина очистки. Соответствующие регионы разделах затем полученную с конфокальной микроскопии, альмычание беспрецедентный визуализация инфицированных клетках-хозяевах и осумкованный паразитов во всей их полноте. Здесь мы предлагаем полный протокол для выявления оптически клиринга и обработки изображений заражены нейронов.