신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em> 생체</em>와<em> 톡소 포자충</em

이 방법의 전체 목표는 고해상도, 의무적 인 세포 내 기생충 톡소 포자충에 감염 개별 뉴런의 3 차원 영상을 얻는 것이다.

톡소 때문에 종종 인간과 설치류를 포함 대형 중간 숙주 범위의 가장 성공적인 기생충 중 하나를 간주됩니다. 인간과 쥐 모두에서, 오염 된 음식이나 물을 섭취를 통해 급성 감염 후, 톡소 플라스마는 양식을 그 느린 복제로의 빠른 복제 양식 (tachyzoite)에서 변환 encysting에 의해 중추 신경계의 지속적인 감염을 일으킬 수있다 (bradyzoite ). 면역 개인,이 잠재 중추 신경계 감염은 비교적 증상이없는 것으로 생각되지만, 에이즈 환자 또는 이식 환자와 같은 면역 개인에, 기생충의 재발은 치명적인 toxoplasmic 뇌염 ^1,2로 이어질 수 있습니다. 또한, 최근의 연구 하메커니즘은 알 수없는 남아 있지만 톡소 플라스마와 잠재 감염, 설치류 ^3,4의 행동 변화로 이어질 수있는 것으로 나타했습니다.

놀랍게도, CNS- 톡소 상호 작용의 중요성을 강조하는 이들 데이터에도 불구하고, 비교적 작은, 특히 세포 및 분자 수준에서,이 관계에 대해 공지되어있다. 뇌 기생충 상호 작용의도 간단한 측면을 연구하는 기능은 technologic의 제한에 의해 부분적으로 방해하고있다. 예를 들어, 대부분의 작업은 뉴런 낭종 전자 현미경 (EM) ^5,6- 수행 한 지속되는 셀임을 나타내는. EM은 높은 해상도를 제공하지만, 그것은 시간이 소요, 노동 집약적, 비싸다. 면역 형광 (IF) 분석은 최근 EM ^(7)에 의해 수행 된 작업을 확인하기 위해 공 초점 현미경과 함께 사용되어왔다. 분석은 수행 할 기술적으로 쉽고 상대적으로 저렴하지만, 언더에 이러한 기술을 사용하는 경우TAND 낭종과 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계는 시간, 기술적으로 어려운 소비하고, 중요한 정보의 손실을 초래할 수있는 시리얼 재건을 필요로한다. 따라서, 우리는 CNS의 톡소 플라즈마 증의 마우스 모델을 사용하고 EM 또는 면역 조직 화학 (IHC)없이 이미지에 감염된 신경 세포의 전체를 우리를 허용 할 수있는 방법을 개발했다. 이러한 기술을 개발함으로써, 우리는 상대적으로 신속하고 저렴한 방법으로 감염된 세포와 낭종 사이의 세포의 관계를 탐구하기 시작할 수 있습니다.

우리가 개발 한 방법은 기생충 단백질 ^9,10 주입 된 생체 세포에 표시하는 시스템과 공 초점 현미경 ^(8)에 의해 광학적으로 청소 및 이미징 두꺼운 뇌 섹션에 대한 새로운 기술을 결합합니다. 이 시스템에서는, 톡소와 재결합 ¹¹ 치운다 매개 된 후에 만 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 치운다 리포터 생쥐에 감염 </em> 적색 형광 단백질 (RFP)를 표현하고 숙주 세포 ^(9)에 Cre 호텔 재조합 효소를 주입 계통. 이 조합은 중추 신경계 감염이 설정된 후, 감염된 마우스의 뇌를 수확 두께 뇌 부분을 잘라 빠르게 RFP ⁺ 낭종을 찾아 이미지에 관련된 영역을 식별 할 수있게 해준다. 또한 GFP의 숙주 세포 발현 GFP ⁺ 세포의 수는 ^{10 기생충을} 포함하지 않는, 기생충 감염에 의해 Cre 호텔의 주입에 전적으로 의존하지 같이 것을 주목하는 것이 중요하다. 이 프로토콜의 목적은 화상 전체의 감염된 뉴런 할 수 있도록하기 때문에, 초점은 GFP ⁺ 또한 RFP ⁺ 낭종이 포함 뉴런이지만, 프로토콜은 또한 이미지에 GFP ⁺ / RFP를 사용할 수 ^– 뉴런.

감염된 뇌 수확 및 절단되면, 섹션은 글리세롤 청산에 의해 투명하게 렌더링됩니다. 섹션들의 적절한 영역이어서 초점 현미경, 알을 촬상감염된 숙주 세포 및 그 전체 포낭 기생충과 같은 전례 시각화. 여기서 우리는 식별을위한 완전한 프로토콜, 광학 청소, 및 이미징 감염된 신경 세포를 제공한다.