感染ニューロンの3-Dイメージングと分析<em>インビボ</em>と<em>トキソプラズマ</em

この方法の全体的な目標は、高解像度、偏性細胞内寄生トキソプラズマ原虫に感染した個々のニューロンの三次元画像を得ることである。

トキソプラズマは、しばしば人間とげっ歯類が含まれ、その大きな中間宿主域、の中で最も成功した寄生虫の一つと考えられている。ヒトとげっ歯類の両方で、汚染された食物や水の摂取を通じて、急性感染後、 トキソプラズマがフォームをそのスロー複製にその速い複製形（タキゾイト）からの変換とシスト化によってCNSの持続感染を引き起こすことが可能である（ブラディゾイト）。免疫応答性個体では、この潜在的な中枢神経系の感染は比較的無症候性であると考えられているが、そのようなエイズ患者や移植レシピエントとして免疫無防備状態の個体では、寄生虫の再燃は、致命的なトキソプラズマ脳炎^1,2につながることができます。加えて、最近の研究ヘクタールメカニズムは不明であるもののトキソプラズマと潜伏感染は、げっ歯類^3,4における行動の変化につながる可能性があることを示したVEの。

驚くべきことに、CNS- トキソプラズマ相互作用の重要性を強調し、これらのデータにもかかわらず、比較的少ない、特に、細胞および分子レベルで、この関係について知られている。脳寄生虫相互作用のさえ単純な側面を研究する能力は、科学技術の限界によって一部に妨げられてきた。例えば、ニューロンは、嚢胞が持続する細胞であることを示す研究の大半は、電子顕微鏡^（EM）5,6を用いて行われてきた。 EMは、高解像度を与えるが、それは時間がかかり、労働集約的で、かつ高価である。免疫蛍光（IF）アッセイは、最近、EM ⁷によって行われた作業を確認するために、共焦点顕微鏡と組み合わせて使用されてきた。アッセイは、実行することが技術的に容易で、比較的安価な、しかしアンダーにこれらの技術を使用している場合嚢胞、感染したニューロン間の空間的関係は、時間がかかるもの、シリアル再建を必要とする技術的に困難であり、貴重な情報の損失につながる可能性がTAND。したがって、我々は、CNSトキソプラズマ症のマウスモデルで使用し、EMまたは免疫組織化学（IHC）のない画像に感染した神経細胞の全体を私たちを可能にすることができる方法を開発した。このような技術を開発することにより、我々は、比較的迅速かつ安価な方法で感染細胞とシストの間に細胞の関係を探求し始めることができます。

私たちが開発した方法は、寄生虫タンパク質^9,10に注入された生体細胞内のマークシステムと共焦点顕微鏡⁸による光学的にクリアとイメージング厚い脳切片の新しい技術を組み合わせたものです。このシステムでは、我々はトキソプラズマとのCre介在組換え後の¹¹緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するのCreレポーターマウスを感染</em>赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現する宿主細胞⁹にCreリコンビナーゼを注入菌株。この組み合わせは、私たちはCNS感染が確立された後、感染したマウスの脳を収穫厚い脳切片を切断し、そして迅速にRFP ⁺嚢胞を見つけることによって、画像に関 ​​連する領域を特定することができる。これは、GFPの宿主細胞発現はGFP ⁺細胞の数は、寄生虫^10が含まれていない、感染に寄生虫のCreの注入のみに依存する、としないように留意することが重要である。ニューロン^–このプロトコルの目的は、画像全体に感染したニューロンにできることがあるので、焦点は唯一のもRFP ⁺嚢胞が含まれていますが、プロトコルは、GFP ⁺ / RFPイメージにも使用することができ、GFP ⁺ニューロンにある。

感染した脳を採取し、区分された後、切片をグリセロールクリアで透明なレンダリングされます。セクションの適切な領域は、その後、共焦点顕微鏡、らで撮像する感染した宿主細胞、および、それらの全体がシスト寄生虫のlowing前例のない可視化。ここでは、識別するための完全なプロトコル、光学的にクリアリング、およびイメージング感染ニューロンを提供する。