3-D imaging e analisi di neuroni infetti<em> In Vivo</em> Con<em> Toxoplasma gondii</em

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere alta risoluzione, immagini tridimensionali di singoli neuroni che sono infettati dal parassita intracellulare obbligato Toxoplasma gondii.

Toxoplasma è spesso considerato uno dei parassiti di maggior successo per la sua vasta gamma ospite intermedio, che comprende l'uomo e roditori. In entrambi gli esseri umani e roditori, dopo l'infezione acuta attraverso l'ingestione di cibo o acqua contaminati, Toxoplasma è in grado di causare una infezione persistente del sistema nervoso centrale convertendo dalla sua forma replica veloce (il tachizoite) per la sua lenta replicante e encysting forma (il bradyzoite ). In individui immunocompetenti, questa infezione CNS latente è pensato per essere relativamente asintomatica, ma in individui immunocompromessi, come i malati di AIDS o pazienti sottoposti a trapianto, recrudescenza del parassita può portare alla fatale encefalite toxoplasmic ^1,2. Inoltre, studi recenti have dimostrato che l'infezione latente da Toxoplasma può portare a cambiamenti comportamentali nei roditori ^3,4, anche se il meccanismo rimane sconosciuto.

Sorprendentemente, nonostante questi dati evidenziano l'importanza dell'interazione CNS- Toxoplasma, relativamente poco si sa su questo rapporto, soprattutto a livello cellulare e molecolare. La possibilità di studiare gli aspetti anche semplici dell'interazione cervello parassita è stata ostacolata in parte dalle limitazioni tecnologiche. Ad esempio, la maggior parte del lavoro dimostrando che i neuroni sono le cellule in cui cisti persistono è stato fatto con microscopia elettronica (EM) ^5,6. Anche se EM dà alta risoluzione, è ad alta intensità di tempo, di lavoro, e costoso. Immunofluorescenza (IF) saggi sono stati recentemente utilizzato in combinazione con la microscopia confocale per confermare il lavoro fatto da EM ^7. Se le analisi sono tecnicamente facili da eseguire e relativamente poco costoso, ma utilizzando queste tecniche per undertand il rapporto spaziale tra la cisti e il neurone infettato richiede la ricostruzione di serie, che richiede molto tempo, tecnicamente difficile, e può portare alla perdita di preziose informazioni. Così, abbiamo sviluppato un metodo che può essere utilizzato con il modello murino di CNS toxoplasmosi e ci permette di immagine la totalità dei neuroni infetti senza EM o immunoistochimica (IHC). Sviluppando tale tecnica, possiamo cominciare a esplorare il rapporto cellulare tra la cellula infettata e la cisti in modo relativamente rapido e poco costoso.

Il metodo abbiamo sviluppato combina più recenti tecniche di compensazione otticamente e sezioni di cervello spessore di imaging mediante microscopia confocale ⁸ con un sistema che segna で cellule in vivo che sono stati iniettati con proteine ​​parassita ^9,10. In questo sistema, abbiamo infettare topi Cre-giornalista che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP) solo dopo ¹¹ ricombinazione Cre-mediata con Toxoplasma </em> Ceppi che esprimono una proteina fluorescente rossa (RFP) e iniettano Cre ricombinasi nelle cellule ospiti ^9. Questa combinazione ci permette di raccogliere il cervello infetto del mouse dopo l'infezione del sistema nervoso centrale è stabilita, tagliare sezioni di cervello di spessore, e rapidamente individuare le aree di pertinenza immagine trovando la RFP ⁺ cisti. È importante notare che, come espressione della GFP cellula ospite dipende unicamente dalla iniezione di Cre da parassiti, infezioni e non su una serie di cellule GFP ⁺ non contengono parassiti ^10. Poiché l'obiettivo di questo protocollo è quello di essere in grado di immagine intere neuroni infettati, l'attenzione è solo sulla GFP ⁺ neuroni che contengono anche un RFP ⁺ cisti, ma il protocollo può essere utilizzato anche per l'immagine della GFP ⁺ / RFP ^– neuroni.

Una volta che il cervello infetto è raccolto e sezionata, le sezioni sono resi trasparente glicerolo compensazione. Regioni appropriate di sezioni sono poi ripreso con microscopia confocale, almuggito visualizzazione senza precedenti di cellule ospiti infette e parassiti incistate nella loro interezza. Qui forniamo un protocollo completo per l'identificazione, la compensazione ottica, e di imaging infetti neuroni.