概要

Imagerie 3-D et de l'analyse des neurones infecté<em> In Vivo</em> Avec<em> Toxoplasma gondii</em

Published: December 09, 2014
doi:

概要

En utilisant ce protocole, nous avons pu coupes de cerveau l'image d'épaisseur de 160 um à partir de souris infectées par le parasite Toxoplasma gondii, qui permet la visualisation et l'analyse de la relation spatiale entre le parasite de enkyster et le neurone infecté.

Abstract

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire avec une large gamme d'hôtes, y compris les humains et les rongeurs. Chez les humains et les rongeurs, Toxoplasma établit une infection persistante à vie dans le cerveau. Bien que cette infection du cerveau est asymptomatique dans la plupart des personnes immunocompétentes, dans le fœtus en développement ou les personnes immunodéprimées telles que les acquis syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) des patients, cette prédilection pour et la persistance dans le cerveau peut entraîner une maladie neurologique dévastatrice. Ainsi, il est clair que l'interaction Toxoplasma cerveaux est essentielle à la maladie symptomatique produite par Toxoplasma, mais nous avons peu de compréhension de l'interaction cellulaire ou moléculaire entre les cellules du système nerveux central (SNC) et le parasite. Dans le modèle murin de la CNS Toxoplasmose il a été connu plus de 30 ans que les neurones sont les cellules dans lesquelles le parasite persiste, mais peu d'informations sont disponibles sur ce quipartie du neurone est généralement infecté (soma, dendrites, axone) et si cette relation cellulaire change entre les souches. En partie, ce manque est secondaire à la difficulté de l'imagerie et la visualisation des neurones infectés entiers d'un animal. De telles images ne nécessite généralement coupes sériées de tissu et les coutures imagées par microscopie électronique ou la microscopie confocale après immunomarquage. En combinant plusieurs techniques, le procédé décrit ici permet d'utiliser des sections épaisses (160 pm) afin d'identifier et de cellules d'image entière qui contiennent des kystes, ce qui permet la visualisation et l'analyse des différents neurones, une infection chronique à trois dimensions sans avoir recours à l'immunomarquage, microscopie électronique ou coupes sériées et les coutures. En utilisant cette technique, nous pouvons commencer à comprendre la relation cellulaire entre le parasite et le neurone infecté.

Introduction

L'objectif global de cette méthode est d'obtenir des images haute résolution en trois dimensions de neurones individuels qui sont infectés par le parasite intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii.

Toxoplasma est souvent considéré comme l'un des parasites les plus réussies en raison de sa large gamme de hôte intermédiaire, qui comprend les humains et les rongeurs. Chez les humains et les rongeurs, après l'infection aiguë par ingestion d'aliments ou d'eau contaminés, Toxoplasma est capable de provoquer une infection persistante du SNC par la conversion de sa forme de réplication rapide (la tachyzoïte) à sa lente réplication et enkyster forme (l'bradyzoïte ). Chez les individus immunocompétents, cette infection latente CNS est pensé pour être relativement asymptomatiques, mais chez les personnes immunodéprimées comme les sidéens ou les receveurs de greffe, la recrudescence du parasite peut conduire à toxoplasmose cérébrale fatale 1,2. En outre, des études récentes have montré que l'infection latente par Toxoplasma peut conduire à des changements de comportement chez les rongeurs 3,4, bien que le mécanisme reste inconnu.

Étonnamment, malgré ces données soulignant l'importance de l'interaction CNS- Toxoplasma, on sait relativement peu de cette relation, en particulier au niveau cellulaire et moléculaire. La possibilité d'étudier les aspects même les plus simples de l'interaction cerveau-parasite a été entravée en partie par des limitations technologiques. Par exemple, la majeure partie du travail montre que les neurones sont les cellules dans lesquelles persistent kystes a été fait avec la microscopie électronique (EM) 5,6. Bien EM donne haute résolution, il est temps, de main-d'œuvre, et coûteux. Immunofluorescence (IF) les essais ont été récemment utilisé en conjonction avec la microscopie confocale pour confirmer le travail effectué par EM 7. Si les analyses sont techniquement facile à réaliser et relativement peu coûteux, mais l'utilisation de ces techniques pour undertand la relation spatiale entre le kyste et le neurone infecté nécessite la reconstruction de série, qui prend du temps, techniquement difficile, et peut conduire à la perte d'informations précieuses. Ainsi, nous avons développé une méthode qui peut être utilisé avec le modèle murin de la CNS toxoplasmose et nous permet de l'image l'ensemble des neurones infectés sans EM ou immunohistochimie (IHC). En développant une telle technique, nous pouvons commencer à explorer la relation cellulaire entre la cellule infectée et le kyste d'une manière relativement rapide et peu coûteuse.

Le procédé que nous avons développé combine les techniques actuellement disponibles pour la compensation optique et des coupes de cerveau épaisseur d'imagerie par microscopie confocale à 8 avec un système qui marque dans les cellules in vivo qui ont été injectées avec des protéines parasitaires 9,10. Dans ce système, on infecte les souris Cre-rapporteurs qui expriment une protéine fluorescente verte (GFP) qu'après la recombinaison médiée par Cre 11 par Toxoplasma </em> Souches qui expriment une protéine fluorescente rouge (RFP) et se injectent la recombinase Cre dans les cellules hôtes 9. Cette combinaison nous permet de récolter le cerveau de souris infectée après l'infection du système nerveux central est établi, couper des sections de cerveau épais, et identifier rapidement les domaines pertinents pour l'image en trouvant la DP + kystes. Il est important de noter que l'expression de la cellule hôte de la GFP dépend uniquement de l'injection de Cre par des parasites, et non sur l'infection, un certain nombre de cellules GFP + ne contiennent pas de parasites 10. Comme l'objectif de ce protocole est de pouvoir neurones infectés images entières, l'accent est mis uniquement sur ​​la GFP + neurones qui contiennent également un appel d'offres + kyste, mais le protocole peut également être utilisé pour l'image de la GFP + / DP neurones.

Une fois que le cerveau infecté est récolté et sectionnée, les sections sont rendus transparents par compensation glycérol. Régions appropriées des articles sont ensuite visualisés en microscopie confocale, alci-visualisation sans précédent de cellules hôtes infectées et les parasites enkystés dans leur intégralité. Ici, nous fournissons un protocole complet pour identifier, de compensation optiquement, et les neurones d'imagerie infectés.

Protocol

NOTE: Les souris ont été élevées et maintenues dans une pièce à température contrôlée et l'humidité de 12 h inversée cycles lumière / obscurité avec de la nourriture et de l'eau disponibles ad libitum à l'Université de l'Arizona. Des expériences ont été menées conformément aux lignes directrices et approbation du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Arizona. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffranc…

Representative Results

Figure 7 comprend des images représentatives de deux GFP + neurones à partir de deux sections 160 um d'épaisseur différentes, ainsi que d'une mesure représentative de la distance à partir de kyste à cellule-corps de la figure 7B. Chiffres contenant kyste 7-A et B montrent que cette nouvelle protocole permet la visualisation du neurone infecté dans son intégralité. La figure 7C montre que cette technique de f…

Discussion

Étant donné que les changements cellulaires dans des cellules hôtes infectées ont été liés aux résultats de la maladie dans les infections avec d'autres organismes intracellulaires tels que le VIH, la rage, et Chlamydia 18,19, nous avons développé une technique qui nous permettrait d'étudier les interactions intimes qui surviennent entre le CNS Cellule hôte et Toxoplasma. La méthode décrite ici atteint cet objectif en permettant l'imagerie efficace des neurones infectés chr…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions l'ensemble du laboratoire Koshy pour des discussions utiles. Nous remercions Patty Jansma et de l'Université de l'Arizona Département Neuroscience conseiller et vous aider avec l'imagerie. Nous remercions également le laboratoire Porreca pour l'utilisation de leur Vibratome. Cette recherche a été financée par le National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK).

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Vibratome Series 1000 Sectioning System Technical Products International, Inc. Other vibratomes are compatible
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Premium Slides Fisher Scientific 12-544-2
#1.5 Coverslips VWR 48393 251
Diamond Scriber VWR 52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope Zeiss LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml Western Medical Supply, Inc. 4165
AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml Lloyd Inc.
ZsGreen Mice Jackson Laboratories 7906 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) HyClone SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100X Corning 30-002-Cl
200mM L-alanyl-L-glutamine Corning 25-015-Cl
25cm2 Canted neck flask Fisher Scientific 1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium VWR 45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade amresco K813-500ml
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079
Bright-Line Hemocytometer Sigma-aldrich Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS005-1
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-aldrich H3393-100KU
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042-500
20ml Disposable Scintillation Vials Fisher Scientific FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof In-house 17212945 This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software Bitplane
Clear nail polish Other brands are compatible
10ml Syringe with Luer-Lok VWR BD309604 Other syringes are compatible
Three-way Stopcock Any brand is compatible
Hypodermic needle Any brand is compatible – used to pin down mouse.
Cell Scraper Any brand is compatible
25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter Greiner Bio-One 450099 Other brands are compatible

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記事を引用
Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).

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