L'uso di stopped-flow fluorescenza ed etichettati nucleotidi di analizzare il ciclo Fatturato ATP di kinesine

Qui, vi presentiamo i protocolli per l'osservazione e l'analisi della cinetica delle transizioni tra gli stati nucleotidiche per una cinesina. Questi protocolli utilizzano il metodo rapida miscelazione stopped-flow in combinazione con nucleotidi fluorescente. Metodi di questo tipo sono stati ampiamente utilizzati per studiare nucleotide vincolante e dissociazione per una varietà di kinesins ^9-11,13-16. I metodi descritti non consentono l'osservazione di rilascio fosfato (Figura 1, punto 3). Tuttavia, stopped-flow fluorescenza può essere utilizzata per osservare questa transizione utilizzando una proteina di rilevamento fosfato di accoppiare la produzione di fosfato ad una variazione di intensità di fluorescenza ^17. I metodi presentati uso nucleotidi marcati con il piccolo methylanthraniloyl fluoroforo (Mant), che in genere mostrano un aumento di intensità di fluorescenza quando si lega alle proteine. Inoltre, il fluoroforo mant, quando coniugato sia al 2 'o 3' la posizione sulla ribose, spesso ha poco o nessun effetto sulla vincolante, dissociazione o idrolisi del nucleotide ^9-12. Nucleotidi Mant-marcati sono facilmente reperibili da fonti commerciali (vedere l'elenco dei materiali) e sono forniti come miscele del 2 'e 3' coniugato quanto rapidamente riequilibrare quando purificato di un singolo isomero ^8. Nucleotidi Mant-marcato fare ottimi molecole giornalista con cui si possono osservare le cinetiche di legame del nucleotide e di dissociazione.

L'uso di nucleotidi fluorescente significa che la lettura dei saggi descritti è un cambiamento in tempo reale di intensità di fluorescenza. Ciò rende questi saggi ideale per stopped-flow fluorescenza, che permette una rapida miscelazione dei reagenti e l'osservazione in tempo reale delle variazioni di fluorescenza associate alla reazione successiva. La combinazione di stopped-flow come la tecnica di miscelazione e fluorescenza come metodo di rilevamento produce un sistema che è ef relativamente campioneficiente. Ad esempio, per acquisire i dati mostrati nella Figura 3C richiede 0,8-1,0 mg di purificato kinesin-13, MCAK, e di acquisire i dati mostrati nella Figura 4B richiede ~ 0,3 mg di purificato kinesin-13, MCAK. Uno svantaggio dell'uso di mant come fluoroforo è che è incline a photobleaching. Ciò può essere osservato in isolamento da chinesina cinetica di reazione miscelando una soluzione di mant nucleotide marcato con tampone di reazione, in assenza di chinesina, nel flusso fermato. Una lenta diminuzione di intensità di fluorescenza si osserva come il gruppo mant diventa sbiancato. Oltre la gamma di tempi utilizzati nei protocolli descritti photobleaching del gruppo Mant è ben descritto da una funzione lineare. Pertanto, un modo semplice per correggere i dati per fotoscolorimento è per adattarsi ad una funzione esponenziale con una linea di base descritto da una funzione lineare (cioè, m + c) anziché la linea di base piatta più comune, descritto da un singolo parametro.

Quando si misura costanti di velocità di associazione e dissociazione di mantATP (Sezione 2) l'ADP, che rimane associato al sito nucleotide-binding kinesina in assenza di microtubuli, deve essere rimosso. Questo permette associazione mantATP e dissociazione (Figura 1, punto 1), da osservare in isolamento da dissociazione ADP. Per raggiungere questo obiettivo la chinesina è incubato con almeno un eccesso di 50 volte di EDTA su siti di legame del nucleotide (Passo 2.1). L'EDTA sequestra Mg ^{2 +} ioni causando Mg ^{2 +} a dissociarsi dalla tasca nucleotide-binding, che si traduce nel rilascio del nucleotide ^11. Pertanto, nello svolgimento passaggi 2,1-2,3, è indispensabile utilizzare un buffer libero di Mg ^{2 +.} La proteina kinesin libero-nucleotide è buffer di scambio per separarlo sia dal nucleotide libero e da EDTA. Per realizzare questa separazione, un usa e getta a caduta gecolonna l filtrazione è sufficiente ed è semplice e rapido da usare (vedere l'elenco dei materiali). L'interazione di mantATP con nucleotide cinesina libera viene effettuata in un intervallo di concentrazioni mantATP (Passo 2.4) per consentire deconvoluzione delle costanti di associazione e dissociazione dei tassi (punto 2.8). La teoria alla base di esperimenti di questo tipo è ben descritto nel riferimento 18 In esecuzione di questi esperimenti si comincia con la più bassa concentrazione di mantATP. Ciò elimina la necessità di fasi di lavaggio tra diverse concentrazioni. Probabilmente sarà necessario regolare la sensibilità del fluorimetro stopped-flow come concentrazione mantATP viene aumentata. La concentrazione mantATP deve essere sempre superiore di almeno 5 volte rispetto alla concentrazione di cinesina nucleotidiche siti di legame per mantenere condizioni di pseudo primo ordine. Tuttavia, poiché la concentrazione di mantATP viene aumentata, la variazione del segnale può diventare inondato come frazione di nucleotide che si lega a chinesina diminuisce. Therefore, la concentrazione della chinesina è anche aumentato per ogni nuova concentrazione di mantATP tale che la concentrazione di mantATP è mai superiore a 10 volte l'eccesso molare rispetto siti di legame del nucleotide (Passo 2.6).

mantADP Dissociazione

Sebbene associazione e dissociazione dei tassi costanti per mantADP possono essere determinati con lo stesso metodo descritto per mantATP (sezione 2). La dissociazione di ADP da una cinesina può essere osservata direttamente dal precarico del sito nucleotide-binding con mantADP (Passi 3,1-3,3) Il complesso mantADP.kinesin viene poi mescolato con un eccesso di ATP senza etichetta (punto 3.5). L'eccesso senza etichetta ATP impedisce la rilegatura del mantADP alla cinesina e quindi permette la reazione di dissociazione (Figura 1, k ₄₎ da osservare in isolamento da un'associazione di mantADP. In questo test la concentrazione di ATP non marcato deve essere almeno un eccesso molare di 50 volte di NUCleotide siti di legame. La teoria alla base di questo saggio è ben descritta in riferimento 18. Questo metodo diretto fornisce un valore più preciso per il tasso costante di dissociazione rispetto alla estrapolazione per l'asse y descritto al punto 2.8.

Inclusione di microtubuli

I metodi descritti possono essere utilizzati per determinare la cinetica di legame nucleotidico e dissociazione in presenza di microtubuli. I microtubuli vengono introdotti alla siringa nucleotide contenente prima della miscela nel flusso fermato: la siringa inferiore nella Figura 3B e 4B (Inserti). In questa configurazione, la chinesina incontrerà il nucleotide allo stesso tempo se corrisponde ai microtubuli. Microtubuli stabilizzati sono utilizzati, in cui la durata del polimero tubulina viene esteso mediante l'uso di una sostanza chimica o stabilizzante, come taxolo, o un analogo GTP nonhydrolysable, come guanosina-5 '- [(α, β) -methyleno] trifosfato (GMPCPP, vedere l'elenco dei materiali). E 'possibile utilizzare due cicli di polimerizzazione della tubulina con GMPCPP fare microtubuli che possono essere conservati per molti mesi a ^9,19 azoto liquido. L'uso di microtubuli pre-preparati riduce in modo significativo le difficoltà pratiche di esecuzione di tali test. Per includere microtubuli nei saggi, è importante utilizzare un tampone di reazione adatta per la stabilità dei microtubuli. Il buffer di scelta è TUBI based, con il buffer più comunemente usato contenente 80 mM pH 6.9 TUBI, 1 MgCl ₂ e 1 EGTA mm mm (noto come BRB80) ^20,21.

I metodi descritti non sono limitati da utilizzare con kinesins, ma possono essere adattati e applicati a qualsiasi proteina di legame nucleotide. Ad esempio, i metodi simili sono stati applicati al ciclo fatturato ATP dei membri della famiglia miosina di motori molecolari ^12,22 e l'uso di mant etichettato nucleotidi guanosina estende ulteriormenteMetodi di questo tipo di idrolizzare proteine ​​GTP ^23,24.