Быстрая и надежная Анализ клеточной и молекулярной поляризации, индуцированной хемокинового сигнализации

Хемокины небольшие растворимые белки, которые привлекают клетки специализированных местах ^1. Таким образом, они участвуют в правильном расположении клеток в тканях, важнейшие функции в процессе развития и физиологии. Иммунная система не является исключением из этого правила, как это полагается по действию многих различных типов клеток, которые действуют сообща, чтобы обеспечить эффективную иммунную реакцию. Управляя конкретного местоположения одного типа иммунных клеток в данном состоянии, хемокины предварительно требуется до чужеродные антигены могут быть обнаружены и нейтрализованы.

В Т-лимфоцитов, в частности, хемокинов связываются со специфическими рецепторами на поверхности, которые, при соединении, вызывают много внутриклеточные сигналы (рост кальция, ERK фосфорилирования, Rho GTPases активации, увеличение Интегрины близость и цитоскелета изменения), которые способствуют Т-клеток моторику ^2,3. На клеточном уровне, можно наблюдать морфологические изменения вызывали на хемокинов стимуляции.Эти изменения в клеточных форм особенно значительным в Т-клеток: покоящиеся Т-клетки имеют борта, как круглый морфологию при движении в потоке крови. Тем не менее, зондирование присутствии хемокинов в местах воспаления или в непосредственной близости от лимфоидных органов собирается изменить форму Т-клеток, в настоящее время принять типичный "ручное зеркало" Морфология, состоящий из биполярного виде: передний край на фронте и заднюю кромку, или Уропод, на задней ^4. Кроме того, внутриклеточные компоненты могут разделять в этих двух противоположных областей поляризованного Т-клеток для поддержания миграции. Например, актиновые филаменты полимеризации увеличивается при стимуляции хемокинов ⁵ и полимеризованного актина накапливается в передней части поляризованного Т-клеток ^2. С другой стороны, некоторые белки, такие как фосфорилированы белков Эзрин-Radixin-Moesin (ERM) семьи, которая свяжет плазматическую мембрану кортикальной F-актина цитоскелета, повторно локализовать в уропода поляризованногоТ-клетки ^6. Интересно, что мы и другие показали, что этот процесс поляризации требуется для Т миграции клеток. Действительно, любое лечение, что мешает поляризации будет ингибирования клеточной подвижности. Например, ингибирование активности членов атипичной протеинкиназ C (РКС) семьи, PKCζ и PKCι блоки T поляризации клеток и их миграции процесс сканирования дендритных клеток ^7. Т-клеток поляризация также регулируется Rho ГТФ. Мы показали, что модуляция активности RhoA по недавно описанного белка Fam65b мешает изменений Т-клеток в морфологии и их способности к миграции в анализе Transwell ^6. Как поляризации является необходимым условием для клеточного шаг подвижности, это, таким образом, важно, чтобы иметь возможность количественно оценить его в качестве основного считывания ответов хемокинов. Формы клеток изменения были ранее измеренное вручную ^8. Тем не менее, этот вид количественного очень много времени, так что, как правило, лишь немногиедесятки клеток учитываются.

Здесь новый метод представлен быстро количественно степень изменения формы Т-лимфоцитов, подверженных хемокинов стимуляции. Поток изображений цитометрии технологии (см таблицу специфических реагентов / Оборудование) используется, которая сочетает в себе преимущества проточной цитометрии и микроскопа ⁹ количественно эффективно количество поляризованных клетках в различных условиях хемокинов стимуляции. В дополнение к количественной оценки морфологических изменений, которые можно измерить энергично с этой технологией, можно также оценить изменения в субклеточном локализации некоторых белков при хемокинов сигнализации.