케모카인 시그널링에 의해 유도 된 세포 및 분자 양극화의 신속하고 강력한 분석
概要
Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.
Abstract
세포는 과정이라고 편광 자신의 원형을 잃고으로 많은 단백질의 세포 내 현지화를 변경하여 자극을 케모카인에 응답합니다. 고전 이미징 기술은 이러한 현상을 연구하는데 사용되어왔다. 그러나 이러한 형태 및 세포의 수만 염색 공동 지역화 시간 소모적 정량화 하였다 많은 세포의 수동 요구를 취득. 여기서, 신속하고 강력한 방법은 사이토의 것과 현미경의 장점을 결합한 기술 계측법 촬상 흐름을 이용하여 상기 셀 수천 이루어진 샘플들에 이러한 현상을 연구하기 위해 설명된다. MHC 클래스 I 분자와 사상 액틴 용 CCL19 염색 자극 T 림프구를 사용하여, 게이팅 전략 동시에 형상 변화의 정도 및 CCL19 시그널링에 의해 영향 마커의 공동 국산화 정도를 측정하기 위해 제공된다. 또한,이 게이팅 전략은 observ 우리를 허용전자 CXCL12 자극 후 편광 T 세포 (전면) 사상 액틴과 (후면) 인산화 Ezrin-Radixin-Moesin (포스 ERM) 단백질의 분리. Par6 / 비정형 PKC 신호 전달 경로의 돌연변이 발현 억제제 및 약리학 적으로 액틴 중합 억제제 등이 기술은 두 개의 서로 다른 편광 소자에 차단 효과를 관찰하는데 유용 하였다. 따라서, 증거는이 기술은 단백질의 형태 학적 변화 및 재분배 모두를 분석하는 유용한 것을 알 수있다.
Introduction
케모카인 전문 위치 1에 세포를 유치 작은 수용성 단백질이다. 따라서, 그들은 조직에서 세포의 정확한 위치, 개발 및 생리에 중요한 기능에 참여하고 있습니다. 이 효과적인 면역 반응을 탑재 콘서트 행동 많은 다른 종류의 세포의 작용에 의존으로 면역 시스템은이 규칙에 예외는 아닙니다. 외부 항원이 검출 중화되기 전에 주어진 상태에서 하나의 면역 세포 유형의 특정 위치를 제어함으로써, 케모카인 장치들이 필요하다.
특히 T 림프구에서, 케모카인은 T 세포 운동성 2,3- 호의 결합시, 다양한 세포 내 신호를 유도하는, 특정한 표면 수용체 (칼슘 증가, ERK 인산화의 Rho GTP 아제 활성, 인테그린 친화 세포 골격 변화의 증가)에 결합한다. 세포 수준에서, 하나는 케모카인 유도 자극에 형태 학적 변화를 관찰 할 수있다.세포 모양에서 이러한 변화는 T 세포에서 특히 극적 : 혈류에 여행 할 때 휴식 T 세포가 구슬처럼 둥근 형태를 가지고있다. 앞에 리딩 에지 : 그러나, 염증 부위에 또는 림프 기관의 근방에서 케모카인의 존재를 감지 해주기 양극성 형태로 이루어진 전형적인 "핸드 미러"형태를 채택하는 T 세포의 모양을 변경하려고 그리고 다시 4에서 트레일 링 에지, 또는 uropod. 또한, 균체 내 성분은 마이그레이션을 유지 편광 T 세포의 두 대향하는 영역으로 분리 할 수있다. 예를 들면, 케모카인 자극 5 및 액틴 중합시 액틴 필라멘트 중합 증가 편광 된 T 세포 (2)의 전방에 축적한다. 한편, 이러한 피질 F 액틴 세포 골격에 세포막 링크 Ezrin-Radixin-Moesin (ERM)과 가족의 인산화 된 단백질과 같은 여러 가지 단백질의 편광 uropod에 다시 문 지역화T 세포 (6). 흥미롭게도, 우리 등이 분극 처리는 T 세포의 이주를 위해 필요하다는 것을 보여 주었다. 실제로, 편광을 방해하는 어떤 치료는 세포의 운동성을 억제합니다. 예를 들어, 비정형 단백질 구성원의 활성의 억제는 C (PKC) 계열, 및 PKCζ PKCι 블록 T 세포와 수지상 세포 편광 7들의 이동성 스캔 과정 키나아제. T 세포 분극도의 Rho GTP 아제에 의해 조절된다. 우리는 최근에 기재된 Fam65b에서 RhoA 의한 단백질 활성의 조절이없이 Transwell 분석 6 마이그레이션 T 세포 형태의 변화 및 능력을 방해 것을 보여 주었다. 편광 세포 운동성위한 필수 단계로서, 케모카인은 응답의 메인 리드로 정량화 할 수있는 것이 결정적으로 중요하다. 세포 모양의 변화는 이전에 수동으로 8 측정 하였다. 그러나, 이러한 종류의 정량은 매우 시간 소모적이며, 그 보통 몇 그래서세포의 수만 고려된다.
여기서, 새로운 방법이 급속 케모카인 자극에 노출 된 T 림프구의 형상 변화의 정도를 정량화하기 위해 제시된다. 기술 계측법 촬상 유동은 케 모킨 자극 상이한 조건에서 효율적으로 편광 된 세포의 양을 정량화하는 유세포 및 현미경 (9)의 이점을 결합하는 데 사용된다 (특정 시약 / 장비의 도표 참조). 하나의 기술이 견고하게 측정 할 수있는 형태 학적 변화의 정량화에 또한, 케모카인 시그널링시 일부 단백질의 세포 내 위치 변화를 평가하는 것도 가능하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
계측법, 신속하고 유익한 게이팅 전략 케모카인 자극에 의해 유도 된 세포 및 분자 이벤트를 분석하는 촬상 흐름의 최신 기술을 사용하는 것이 제시된다. 케모카인 자극 분극 공정 동안 서로 다른 단백질의 세포 내 분포에 의해 유도 된 세포 형태의 변화 : 하나의 실험에서, 하나는 정보의 두 가지 유형을 얻을 수있다. 흥미로운 증거가 통계적 견고성과 전체 세포 집단의 작은 부분의 분석이 ?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 크게 피에르 Bourdoncle, 토마스 길버트와 코친 이미징 시설의 루이스 Rimbault을 인정합니다. 이 작품은 INSERM, CNRS와 리그 국립 contre 르 암 (퀴프의 labellisée)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description (optional) |
| RPMI | Gibco | 61870-010 | |
| Human serum AB | PAA | C11-021 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Fetal calf serum | PAN Biotech | P30-3300 | Pre-heat to inactivate the complement. |
| Human T cell nucleofactor kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Murine IL7 | Peprotech | 217-17 | |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| Murine CCL19 | Peprotech | 250-27B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CCL19 | Peprotech | 300-29B | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. |
| Human CXCL12 | Peprotech | 300-28A | Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells. |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-8-100 | This is a 8 % PFA solution in water. Mix volume to volume with 2X PBS to obtain a 4 % PFA solution in PBS. |
| BSA | Sigma | A3059 | |
| Saponin | Fluka | 84510 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Invitrogen | A12381 | |
| FITC-anti-HLA-ABC antibody | Beckman Coulter | IM1838 | clone B9.12.1 |
| Anti-P-ERM antibody | Cell Signaling Technology | 3149P | |
| ImageStreamx Mark II | Amnis |
参考文献
- Rossi, D., Zlotnik, A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).
- Thelen, M., Stein, J. V. How chemokines invite leukocytes to dance. Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).
- Rougerie, P., Rho Delon, J. GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation. Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).
- Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions. Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).
- Adams, D. H., et al. Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).
- Rougerie, P., et al. Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration. J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).
- Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior. J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).
- Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen. Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), 409 (2007).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Freeley, M., et al. L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes. J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).
