Snelle en robuuste analyse van Cellulaire en Moleculaire Polarisatie geïnduceerd door Chemokine Signaling

Chemokines zijn kleine oplosbare eiwitten die cellen aan te trekken om gespecialiseerde locaties ^1. Daarom zij deelnemen aan de juiste positionering van de cellen in weefsels, een cruciale functie in de ontwikkeling en fysiologie. Het immuunsysteem is geen uitzondering op deze regel als het gebaseerd is op de actie van vele verschillende celtypen die in onderling overleg handelen om een ​​effectieve immuunrespons. Door het regelen van de specifieke locatie van een immuun celtype in een bepaalde toestand, chemokinen vooraf vereist voordat vreemde antigenen kunnen worden gedetecteerd en geneutraliseerd.

In T-lymfocyten in het bijzonder, chemokines binden aan specifieke oppervlak receptoren die, de huisbediende ontlokken vele intracellulaire signalen (calcium stijging, ERK fosforylering, Rho GTPasen activering, toename van integrines affiniteit en cytoskelet wijzigingen) dat T-cel beweeglijkheid ^2,3 bevoordelen. Op cellulair niveau, kan men morfologische wijzigingen geïnduceerd op chemokine stimulatie observeren.Deze veranderingen in cel vormen zijn bijzonder dramatisch in T-cellen: rustende T cellen een druppelvormig ronde morfologie reizen binnen de bloedstroom. De detectie van de aanwezigheid van chemokinen in ontstekingsplaatsen of nabijheid van lymfoïde organen zal de vorm van T-cellen die nu vast een typische "hand-mirror" morfologie bestaande uit een bipolaire vorm veranderen: een leidende rand aan de voorzijde en een achterste rand, of Uropode, aan de achterkant ^4. Daarnaast kunnen intracellulaire componenten gescheiden in de twee tegenoverliggende gebieden van een gepolariseerde T-cel migratie ondersteunen. Bijvoorbeeld, actine filamenten polymerisatie stijgt op chemokine stimulatie ⁵ en gepolymeriseerd actine accumuleert aan de voorzijde van een gepolariseerde T-cel ^2. Anderzijds, verscheidene eiwitten, zoals gefosforyleerde eiwitten van de Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) familie die het plasmamembraan koppelen aan de corticale F-actine cytoskelet, opnieuw lokaliseren de Uropode gepolariseerdeT-cellen ^6. Interessant wij en anderen hebben aangetoond dat dit polarisatieproces vereist voor T celmigratie. Inderdaad, zal er geen behandeling die interfereert met polarisatie cellulaire beweeglijkheid remmen. Bijvoorbeeld, remming van de activiteit van de leden van de atypische eiwitkinasen C (PKC) families, PKCζ en PKCι blokken T cel polarisatie en hun trekkende scannen van dendritische cellen ^7. T-cel polarisatie wordt ook geregeld door Rho GTPasen. We hebben aangetoond dat de modulatie van RhoA activiteit van de recent beschreven Fam65b eiwit interfereert met T cel veranderingen in morfologie en hun vermogen om te migreren in Transwell assay ^6. Als polarisatie voorwaarde stap voor cellulaire motiliteit, is dus cruciaal te kunnen kwantificeren als belangrijkste uitlezen van chemokine reacties. Cel vorm verbouwingen waren eerder handmatig ⁸ gemeten. Echter, dergelijke kwantificering is zeer tijdrovend, waardoor gewoonlijk slechts enkeletientallen cellen rekening gehouden.

Hier wordt een nieuwe methode voorgesteld om snel kwantificeren van de mate van veranderingen vorm van T-lymfocyten blootgesteld aan stimulatie chemokine. Een imaging flowcytometrie technologie (zie tabel specifieke reagentia / Apparatuur) gebruikt, die de voordelen van een stromingscytometer en een microscoop ⁹ combineert efficiënt kwantificeren van de hoeveelheid gepolariseerde cellen onder verschillende condities van chemokine stimulatie. Naast de kwantificering van de morfologische veranderingen die robuust kan meten met deze techniek, is het ook mogelijk om veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van sommige eiwitten op chemokine signalering evalueren.