小説<em>インビトロ</em>ヒト全血と内皮の間の相互作用を研究するためのモデル
概要
The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).
Abstract
すべての既知の疾患の大部分は、心血管系の障害を伴う。心血管病態中に活性化相互作用する経路の複雑さへの研究は、しかし、堅牢かつ生理学的に関連する方法の欠如によって制限されている。病理学的な血管イベントをモデル化するために、我々は、内皮および全血の間の相互作用を研究するためのインビトロアッセイを開発した。アッセイは、ヒト全血と接触して配置されている一次ヒト内皮細胞から構成されている。この方法は、血管内に存在する分子と細胞成分との間の微妙な相互作用の研究を可能にする、全くないか非常に少ない抗凝固剤とのネイティブな血液を利用しています。
我々は、またはヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）なしでインキュベートし、異なる血液容量によって凝固の活性を比較することによって、アッセイの機能性を調べた。大きな血液量はに貢献したのに対し、トロンビンはアンチトロンビン（TAT）複合体の形成の増加は、HUVECの存在は、凝固の減少活性化をもたらした。さらに、本 発明者らは、腫瘍壊死因子（TNFα）で刺激し、CD16 +細胞の存在は、TNFαに有意に高いことが見出さHUVECへの白血球の付着の画像解析を適用し、血液接触後の非刺激細胞と比較して、細胞を刺激した。結論として、アッセイは、内皮および血液区画との間の相互作用が乱されている血管の病理を研究するために適用することができる。
Introduction
心血管疾患、血液血管の相互作用を分析するための方法は、一般に、動物研究実験を含む。実験的研究、動物モデルで作成された結果はこのように、しかし、ヒトの疾患のほとんど、または全く意味を有していてもよい1,2、血液区画と血管内皮細胞間の細胞間相互作用を調査するためのインビトロモデルにおいて良好で信頼性のための必要性がある人間のようなシステム。そこで我々は、血液内皮細胞チャンバーモデルを確立している。これは、生体材料とヒト全血との間の相互作用を調査するために使用前に説明したモデルに基づいている。通常、精製された成分の数を制限し、他のin vitroでのセットアップの3反しすなわち、血小板は、白血球または内皮細胞が利用可能で、現在のモデルは、すべて組み込まれて血管中に存在する成分。
血液内皮cの設定エル室モデルはほとんど、または全く追加の抗凝固剤との新たに採取したヒト血液の使用を可能にするように設計されている。より長い期間の間保存された血液は、赤血球の破壊は、血液および内皮細胞との間の微妙な相互作用を妨害し得る、いわゆる記憶病変を取得する。4
ex vivoでの全血の取り扱い中に血餅形成を回避するために抗凝固剤または血液と接触するすべての材料が非活性である必要は、高用量のいずれかを必要とする。非活性化表面のような材料は、代替的に固定化されたヘパリンの保護層を備えていてもよい、実験室環境ではまれである。血液接触は、凝固カスケードの活性化を引き起こすことなく、発生する可能性表面を形成する大部分の材料に適用することができる固定化されたヘパリンの保護層（以下、Corlineヘパリン表面（CHS）と呼ばれる）。5したがって、とチャンバ家具によってCHS、血液内皮CEllの室モデルは、血液中の抗凝固剤の非常に低い濃度の使用を可能にする。血液内皮室モデルにおける抗凝固剤の高濃度の添加を回避する他の方法でマスクされる可能性があり、血管内の敏感な相互作用を研究することを可能にする。6
プラスチック製顕微鏡スライドに：;（9ミリメートル、半径8ミリメートル、高さ）の血液内皮細胞室モデルは、プラスチック製のシリンダーを取り付けることにより形成された二つの室から構成されています。シリンダーに上向きに縁が細胞培養スライドに対してチャンバーを密封するため使用されるゴムのOリングが付いていた溝が付いています。チャンバは部分的にしかチャンバは、その後、垂直位置（ 図1）に回転すると、チャンバ内に残された空気が移動中の血液を保持するように、血液で満たされている。
モデルの機能性を評価するために、我々は完全に被覆されたCHSのいずれかで実験を行ったチャンバまたはヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）。二つの別々の血液量をアッセイし、トロンビンアンチトロンビン（TAT）複合体（凝集の間接的マーカー）の形成は、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）で測定した。次に、血液量の影響を評価し、腫瘍壊死因子（TNFα）は、画像解析により、白血球動員に内皮細胞を刺激した。
血液内皮細胞室モデルの1.セットアップ図。 （A）上部PMMAで作ら血液チャンバの概略図を表示する。（B）一次ヒト内皮細胞を、1ウェルチャンバースライド上で培養される。新鮮ヒト全血を、顕微鏡スライド上の2つのチャンバに添加される。チャンバおよび血液を処理するために使用されるすべての材料は、保護HSコーティングで処理される。 CEの壁を除去した後llの培養スライドは、細胞は血液に面して配置され、システムがシャットダウンをクランプする。（C）血液内皮細胞チャンバを37°Cで回転させながらインキュベートする。その後、血液区画における反応は、ELISAによって分析され、内皮細胞は、顕微鏡検査によって分析することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
血液と血管壁との間の複数の相互作用は、通常による内皮の非粘着性および抗血栓性のために静止状態に維持される。7炎症を伴う病理学的状態の間、内皮は接着受容体の発現8で得られた増加と活性化され止血を阻害する能力が低下。今度は血液中のカスケードシステムの9の活性化は、さらに血栓症および白血球動員を引き起こす内皮の血栓形成を増幅する。10内皮細胞および全血の間のこの微妙な相互作用のより良い理解を得るために、我々は持っている培養された内皮細胞は、全血と接触して配置されているインビトロ方法における新規に開発した。我々の知る限りでは、私たちのセットアップは、より長い期間のために全く又はほとんどない抗凝固剤とのヒト全血とインキュベートした内皮細胞を示す最初のものである。
塩基 ">このシステムの感度は、血液と接触して配置されるすべての表面上に固定化されたヘパリンの保護層と組み合わせてオープン系静脈穿刺によってイネーブルされる。血液調達中に開放系の使用は、静脈穿刺時に、カスケードシステムの活性化を減少させる抗凝固剤の自己決定された量の使用を可能にしながら、市販の真空に血液チューブは、しかし、研究の意図されたエンドポイントに応じて使用することができる。ほとんどの市販のクローズドシステムのチューブに加え、抗凝固剤の最終濃度を敏感阻害することができる、そうでなければ、ハード設定で、相互作用を研究するために、図6を保護ヘパリン表面はさらに、内皮細胞以外の表面による面接触を通る血液の活性化を排除する5確かに、未分画ヘパリンの少量を補充した全血のインキュベーションCHSの保護なしチャンバは、血餅形成をもたらした。 <pクラス= "jove_content">チャンバー内部の気泡は、内皮細胞とのインキュベーションの間、血液の混合を可能にします。気泡サイズの影響を評価するために、我々は2つの異なる血液容量を用いた。このモデルでは、我々は、HUVECとインキュベートしたチャンバ内にかかわらず、気泡の大きさの類似のTATレベルを測定した。 TATは、しかし、完全にCHS室治療に小さな気泡サイズが増加した。これは、前述した内皮細胞の特性11によれば、不活性CHSチャンバ内で不足している内皮細胞によって提供される凝固の増大した活性化の際に調節効果を示す。システム内の気泡は、チャンバの回転時の流れを生成する。バブルのサイズは、この回転システム内の力に影響を与えます。これは、より小さな気泡が血液すなわち時に減少した力を表す高いTAT値、血液の動きを作成した図2Dにおける我々の結果で示されているチャンバ内に低く、それによってカスケード系の活性化は、より高い程度で起こる。それは、このシステムでは、我々は壁や中央で最低に沿って最高速度で室内全体にスピードでは異なるであろう回転流を作成していることに言及すべきである。これは明らかに内皮細胞に対して流動する点とせん断応力との最適な環境ではないが、それでも、我々は安定した再現性のある結果を生成するシステムを有する。より最適な条件は、乱流の非存在下で循環する層流を含むであろう。これは、ここに表示されるモデルでは、しかし、不可能であり、我々の知識にこのようなシステムは、現在まで利用できません。 、システムに追加の抗凝固剤なしまたは低レベルの全血を用いて組み合わせることが可能ではない、いくつかのマイクロ流体システム市販さがあるが、それによって血液および内皮細胞に存在するすべての成分間の相互作用を適切に敏感な評価を可能にすることができない。さらに、TNFαは、独立して、血液量のTATの重形成と組み合わせてHUVEC活性化に向けて血液細胞の動員における2倍の増加があった。これは、モデル系の安定性を検証し、また、全血との組合せで活性化された内皮細胞を使用する可能性を示している。将来、血液内皮細胞チャンバは、活性化の様々な条件やステージの下の細胞上で発現されるマーカーの種々の活性化内皮細胞に対する白血球の動員を調査するために使用することができる。さらに、モデルは、炎症状態に対する効果を評価するために、薬理学的薬剤と組み合わせて使用することができる。
要約すると、我々は、血管疾患の関連性の調査を実行するためにインビトロ系で完全なヒトを作成するためにヒト血液と血管細胞とチャンバモデルを組み合わせて大きな利点を示す。
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、n 602699（DIREKTを）°グラント契約の下、スウェーデンの研究評議会（90293501、A0290401、A0290402）、欧州共同体の第7次フレームワークプログラムからの助成金によって支えられ、NovoNordisk財団、GurliとエドワードBrunnberg財団は、セラピー、Vleugel幹財団とオーケWiberg財団。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
| Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
| TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
| Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
| Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
| EDTA | Sigma | E-6758 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
| 1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
| Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
| Clamps | Office Depot | 2052204 | |
| Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
| Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
| Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
| K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20 |
| PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
| Light microscope | Nikon | TS100 | |
| Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |
参考文献
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin. Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).
- Doctor, A., Spinella, P. Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In. Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).
- Andersson, J., et al. Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro. J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).
- Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).
- Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium. J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).
- Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors. J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).
- Esmon, C. T. Molecular circuits in thrombosis and inflammation. Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).
- Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States. N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).
