The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).
大多数的所有已知的疾病都伴有心血管系统的疾病。研究入期间心血管病理活化的相互作用途径的复杂性,然而,受限于缺乏鲁棒和生理相关的方法。以模型的病理血管事件我们已经开发了一种在体外测定法用于研究内皮细胞和全血之间的相互作用。该测定法包括原代人内皮细胞,其被放置在与人全血接触的。该方法利用天然血液,没有或很少抗凝剂,使存在于血管内的分子和细胞成分之间微妙的相互作用的研究。
我们通过培养具有或不具有人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的不同血液体积比较活化凝血研究该测定的功能。而一个更大的血量贡献增加抗凝血酶的形成(TAT)复合物,血管内皮细胞的存在导致凝血的活化减少。此外,我们采用白细胞附着的图像分析,以内皮细胞刺激肿瘤坏死因子α(TNFα),并发现CD16 +细胞的存在是显著更高的TNFα刺激的细胞相比,经血液接触的未刺激的细胞。最后,该分析可用于研究血管病症,其中血管内皮细胞和血液舱之间的相互作用被扰动。
方法分析在心血管疾病的血液血管的相互作用通常涉及的动物实验研究。在实验研究的动物模型中创建的结果可能,但是,有很少或没有含意为人类疾病。1,2-因此,有必要对在体外模型中良好和可靠的调查血液舱和血管内皮细胞之间的细胞相互作用一类人制度。因此,我们已经建立了一个血内皮细胞腔模型。这是基于用于研究生物材料和人全血之间的相互作用以前描述的模型。3相反,其他的体外设置在那里通常是有限的纯化组分,对数,即,血小板,白细胞或内皮细胞是可用的,在本模型中包含的所有各组分存在于血管中。
血内皮细胞C中的设置ELL室模型是为了让使用新鲜抽取的人血液中很少或根本没有添加抗凝剂。血液在较长的时间内存储收购所谓的存储病灶,其中红细胞的破裂可能与血液和血管内皮细胞之间的微妙交互干扰。4
为了避免处理的全血离体中凝块的形成需要或高剂量的抗凝血剂,或在与血液接触的所有材料必须是不激活的。作为非活化表面是罕见在实验室环境中,材料可以替代地设有固定化肝素的保护层。固定化肝素的保护层(以下简称为Corline肝素表面(CHS)),其可以被应用到大多数材料创造一个表面,其中血液接触可以发生而不引起凝血级联的活化。5。因此,通过提供所述腔室与CHS,血液中内皮CELL室模型允许使用非常低浓度的抗凝血剂的血液中。避免加入高浓度的抗凝血剂的血液内皮室模型的使得能够研究在血管内,否则可能会被屏蔽敏感的相互作用。6
血液内皮细胞室模型包括通过将塑料圆柱体形成的两个腔室(高度:8毫米;半径:9毫米),一个塑料显微镜载玻片。朝上的气缸的边缘都配有该配有用于密封腔室对细胞培养片橡胶O形环的槽。所述腔室仅部分填充有血液的左腔室中的空气保持血液中运动时,腔室中的垂直位置( 图1)随后被转动。
为了评估该模型的功能,我们进行了与任一个完全的CHS涂布实验室或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。两个单独的血液量进行测定和凝血酶抗凝血酶(TAT)复合物(凝结的间接标记物)的形成,测定用酶联免疫吸附试验(ELISA)。然后我们评价了血液体积和肿瘤坏死因子α(TNFα),通过图像分析刺激对白细胞募集的内皮细胞的影响。
图1.设置血液内皮细胞腔模型。 (A)顶视图血室PMMA制成的示意图。(B)原代人内皮细胞上的1孔玻片培养。人的新鲜全血加入到两个室在显微镜载玻片上。用于处理血液室,所有的材料都被有保护HS涂层。除去策的壁后LL培养载玻片,细胞被置于面向血液和系统被夹紧关闭。(℃)的血液内皮细胞的腔室,然后在旋转下在37℃温育。之后,血液中的隔室中的反应可通过ELISA进行分析,并在内皮细胞中可通过显微镜进行分析。
血液和血管壁之间的多重相互作用,通常是由于血管内皮细胞的非粘性和抗血栓形成的性质保持在静止状态。7在涉及炎症的病理条件下,内皮细胞与一个结果增加了粘附受体表达8激活和能力下降,抑制止血9激活的级联系统中的血液又将放大内皮细胞的血栓造成进一步的血栓形成和白细胞招聘10至获得的内皮细胞和全血之间的这种微妙的互动更好地了解,我们有开发的体外方法的新型其中培养的内皮细胞被放置在与全血接触。就我们所知,我们的设置是第一个显示孵育的人全血,没有或很少抗凝剂为更长的时间周期的内皮细胞。
核苷酸“>该系统的灵敏度是由开放系统静脉穿刺术使能结合固定化的肝素对放置在与血液接触的所有表面的保护层。静脉穿刺过程中的开放式系统的过程中血液采购的使用减少了级联系统的激活而允许使用的抗凝血剂的自确定量。市售的真空血液试管可能,但是,可根据不同的研究的目的终点所用。抗凝剂添加到大多数市售的封闭系统管中的最终浓度可以抑制敏感和以其他方式难以学习,相互作用在设定6的保护肝素表面进一步消除了活化的血液通过由比内皮细胞以外的其他表面上的表面接触。5实际上,全血补充有少量肝素的培养室内没有CHS的保护导致血块形成。 <p类=“jove_content”>气泡的腔室内部可以使血液的混合培养的内皮细胞中。为了评估气泡尺寸的效果,我们使用两种不同的血液容量。在这个模型中,我们在腔室孵育的HUVEC测定类似的TAT水平不管气泡大小。 TAT是,然而,随着一个小气泡尺寸的充分的CHS处理腔室。此,按照先前所描述的内皮细胞的特性如图11所示 ,表明凝血活性增加由缺乏在惰性CHS室中的内皮细胞提供时的调节作用。气泡中,系统创建于腔室的旋转流。气泡的大小会影响到该旋转系统内的力。这示出由我们在图2D的结果是一个更小的气泡产生代表经血液即下降力更高的TAT值,使血液运动内的腔室是较低并由此激活级联系统的出现,以更高的程度。应当提到,在本系统中,我们创建了一个旋转流,就可以在不同速度沿腔体沿着墙壁和最低的中心的最高速度。这显然不是关于流动和剪切应力对内皮细胞的最佳环境,但我们仍然有一个系统产生稳定的和可重复的结果。更理想的情况应包括循环在没有湍流的层流。这是,然而,不可能在这里所表示的模型,并以我们的知识这样的系统不提供更新。虽然有几种微流体系统可商购是不可能用全血,无或低的水平抗凝剂添加到系统中的结合,从而不使相互作用的适当敏感的评价存在于血液和内皮细胞的所有部件之间的。此外,有一个增加2倍于招聘血细胞对TNFα活化的HUVEC结合有加倍形成的TAT独立的血液量。这验证了该模型系统的稳定性,同时还示出了使用活化的内皮细胞与全血组合的可能性。未来上,血内皮细胞腔室可用于通过多种表达于各种条件和活化的阶段下的细胞标志物的研究对活化的内皮细胞的血细胞募集。此外,该模型可以用于在用药剂组合,以评价对炎症的影响。
总之,我们显示结合人血和血管细胞的腔室模型来创建在体外系统中的完整的人来执行血管疾病有关的调查并大有裨益。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由瑞典研究理事会(90293501,A0290401,A0290402),欧盟第七框架计划资助下的赠款协议支持N°602699(的DirEKt),该NovoNordisk基金会,Gurli和爱德华Brunnberg基金会,干疗法,Vleugel基金会和阿克维贝格基金会。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC) | PromoCell | C-12200 | Any other type of primary human endothelial cell may be used. |
Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV) | PromoCell | C-22120 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G-2500 | Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells. |
TAT ELISA | Enzyme Research Lab. | TAT-EIA-C | |
Mouse anti-human CD16 | DAKO | F7011 | Dilution 1:100 |
Goat anti-mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11001 | Dilution 1:500 |
Phalloidin-Texas Red | Molecular Probes | A22287 | Dilution 1:200 |
DAPI | Molecular Probes | D1306 | Dilution 10 μg/ml |
EDTA | Sigma | E-6758 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco Life Tecnologies | 25200-056 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437 | |
1 well cell culture slides | BD Falcon | 354101 | |
Blood Chambers | NA | NA | Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS |
Clamps | Office Depot | 2052204 | |
Corline Heparin Surface (CHS) | Corline Systems AB | 945-00 | |
Hypodermic needle | Terumo | NN-1850R | Size: 18 G x 5 mm |
Unfractionated Heparin (UFH) | Leo Pharma | 585679 | |
K3EDTA | Alfa Aesar | 1709958 | Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20 |
PFA | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
Fluorescence microscope | Nikon | 80i | |
Light microscope | Nikon | TS100 | |
Image analysis software | Broad Institute | CellProfiler | Available for free at www.cellprofiler.org |