This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.
Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.
Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive “plaquing” cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9.
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV∆51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.
L'approccio basato luciferasi-qui descritta fornisce una serie di vantaggi rispetto ad altri metodi esistenti, compresa la sua facilità, rapidità, minima necessità di attrezzature, e relativamente a basso costo. Un contributo fondamentale a questo è quello di evitare una fase di diluizione seriale. Tuttavia, i derivati di serie a base di diluizione, di questo protocollo sono certamente fattibile e sono stati recentemente utilizzati per valutare-luciferasi che esprimono Ebola titoli in uno schermo antivirale high-throughput 11. Mentre intrinsecamente più tempo e più costoso, tali adattamenti possono fornire una maggiore gamma dinamica per la quantificazione virale quando necessario. Oltre ad essere particolarmente adatto per la valutazione titoli virali nel contesto degli schermi high-throughput, il nostro metodo di quantificazione virale base di uno stadio luciferasi genera stime accurate di virioni infettivi nel caso di replicare virus. Inoltre, letture di luminescenza insieme ai dati di citotossicità dello stesso esperimento danno una piùquadro completo l'effetto delle condizioni sperimentali su cellule bersaglio, che è particolarmente utile nel contesto di virus oncolitici e schermi di droga.
L'esempio qui illustrato utilizza un replicante virus RNA a singolo filamento negativo; Tuttavia, questo protocollo può essere adattato ad un numero di replicare e non replicanti virus con pochi adattamenti protocollo minori. Questo include virus a DNA come vaccinico, HSV, e AAV (vedi Figura 5). I campioni infettati da virus intracellulari, come il virus vaccinico, ad esempio, richiedono un passo virus-release prima di quantificazione (ad esempio, almeno un ciclo gelo-disgelo). Quando si applica questa tecnica ad altri virus, è necessario ottimizzare il tempo di incubazione dal trasferimento del surnatante virale o lisato alla lettura delle piastre dal luminometro. Questo parametro dipende principalmente dal ciclo di replicazione del virus nella linea cellulare permissiva e la forza del promoter guida espressione luciferasi. Questo è fatto meglio usando la curva standard completa nella fase di ottimizzazione. Per fare questo, si deve infettare la linea cellulare permissiva appropriata con varie repliche della curva standard preparata e leggere ogni replica in un momento diverso punti post-trasferimento. Idealmente, un punto di tempo di incubazione è scelto che conduce ad una relazione lineare tra LOG (RLU) e LOG (titolo) che attraversa il campionario titolo atteso. Per VSVΔ51-Fluc, questo è in genere da 10 a 4 pfu / ml -10 7 pfu / ml per un tempo di incubazione 5 ore. Se titoli inferiori o superiori sono attesi da campioni, si può semplicemente aumentare o ridurre il tempo di incubazione, rispettivamente. In alternativa, i campioni possono essere diluiti per rientrare nel campo di quanto avviene tipicamente per ELISA.
Come accennato in precedenza, questo metodo è adatto per eseguire droga schermi high-throughput utilizzando librerie di droga, come la maggior parte delle operazioni possono essere automatizzate. Le cellule possono essere placcati efficiently utilizzando un dispensatore di micropiastre automatico, la biblioteca farmaco può essere aggiunto utilizzando un gestore di liquido a 96 canali, virus può essere aggiunto utilizzando un dispenser di micropiastre e piastre leggere utilizzando un luminometro automatico. In teoria, questo può anche essere adattato a 384 pozzetti o formati più piccoli; tuttavia, la limitazione a tal fine è il numero di cellule che possono essere placcato, dato minor numero di cellule porta ad una gamma più ristretta nella linearità del LOG (RLU) a LOG (Titer) rapporto. Infine, la valutazione della vitalità cellulare mediante resazurina o altri coloranti metabolici può essere facilmente integrato nel flusso di lavoro, consentendo la discriminazione di composti citotossici in schermi antivirali o identificazione di composti che portano alla uccisione sinergica in combinazione con virus 12. Tuttavia, le limitazioni di questo metodo includono il requisito di un virus transgene che esprime la luciferasi, che non è sempre possibile, e la disponibilità di una linea cellulare permissiva sufficientemente. Tuttavia, è probabile possibile adattareil metodo usato con altri geni reporter (per esempio, GFP), se il metodo di quantificazione giornalista ha una linearità adatto e rapporto segnale rumore. In generale, il metodo high-throughput descritto può essere modificato per soddisfare molti virus diversi e su misura per diverse applicazioni.
The authors have nothing to disclose.
Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1mM solution, pH 7.3 |
alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96 well plate |
Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |