פרוטוקול להדביק<em> Elegans Caenorhabditis</em> עם<em> Typhimurium סלמונלה</em
概要
סי אלגנס התפתחה כמודל גנטי חדש כדי לחקור אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן. כאן אנו מתארים פרוטוקול להדביק ג elegans עם typhimurium סלמונלה בשילוב עם טכניקת התערבות RNAi גדיל פעמיים כדי לבחון את התפקיד של גנים מארח בהגנה מפני זיהום סלמונלה.
Abstract
בעשור האחרון, ג elegans התפתחה האורגניזם חסר חוליות ללמוד אינטראקציות בין מארחים ופתוגנים, כולל ההגנה המארחת נגד סלמונלה typhimurium חיידק גראם שלילי. סלמונלה קובעת זיהום מתמשך במעי של ג elegans ותוצאות במוות המוקדם של בעלי חיים נגועים. מספר מנגנוני חסינות זוהה בג elegans כדי להתגונן מפני זיהומי סלמונלה. Autophagy, מסלול השפלה lysosomal אבולוציונית שימור, הוכח להגביל את שכפול סלמונלה בג elegans וביונקים. הנה, בפרוטוקול מתואר להדביק ג elegans עם typhimurium סלמונלה, שבו התולעים נחשפים לסלמונלה לזמן מוגבל, בדומה לזיהום סלמונלה בבני אדם. זיהום סלמונלה מקצר את תוחלת החיים של ג באופן משמעותי elegans </ Em>. שימוש בגן autophagy החיוני BEC-1 כדוגמא, אנחנו בשילוב שיטת זיהום זה עם ג elegans RNAi האכלת גישה והראה פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון את תפקידו של ג גנים מארח elegans בהגנה מפני זיהום סלמונלה. מאז ג elegans ספריות RNAi הגנום כולו זמינות, פרוטוקול זה מאפשר למסך באופן מקיף לג גנים elegans כי להגן מפני סלמונלה ופתוגנים מעיים אחרים באמצעות ספריות RNAi הגנום כולו.
Introduction
נמטודות הקרקע המתגוררות ללא Caenorhabditis elegans היא אורגניזם מודל פשוט וגנטי צייתן שימוש ללמוד הרבה שאלות ביולוגיות. ג elegans דומיננטי קיים כהרמפרודיטים דישון עצמיים. זכרים שנוצרו באופן ספונטני על ידי אי – חוסר התאמה של כרומוזום X במהלך 1,2 gametogenesis. בנוכחותו של מזון בשפע, ג elegans לפתח ברציפות בארבעה שלבי זחל למבוגרים. טמפרטורה גם משפיעה ג פיתוח elegans; פיתוח מהיר יותר היא נצפתה בטמפרטורות גבוהות יותר. במעבדה, ג elegans הוא תרבית בטמפרטורה סטנדרטית של C ° 20 על צלחות אגר עם coli Escherichia זרע החיידק (זן OP50) כמזון 1,2.
בעשור האחרון, ג elegans התפתחה האורגניזם חסר חוליות ללמוד אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן 3-5. בטבע, ג elegans אוכל חיידקים כnutrien1,2 המקור לא. האוכל שלה נורמלי חיידקים במעבדה, OP50, ניתן להחליף בקלות עם פתוגנים אחרים כדי לבחון את יחסי הגומלין בין ג elegans וכל פתוגן שנבחר. בתנאים אלה, המעי הוא האתר העיקרי של הזיהום. אכן, מגוון רחב של חיידקים פתוגנים הוכח להדביק קטלני ג elegans 3-5.
סלמונלה חיידק גראם שלילי היא הפתוגן במערכת העיכול שגורם למחלות שמקורן במזון לבני אדם ברחבי העולם 6,7. ג elegans הוא מארח מודל טוב לסלמונלה typhimurium כחיידק הזה משכפל ותערוכות דלקות מעיים מתמשכות 8-10. ג elegans נעשה שימוש כדי לזהות גם רומן וארסיות סלמונלה ידועה קודם לכן גורמי 11. מעניין לציין, כי ג מערכת חיסונית elegans מגבילה הצלחת שכפול סלמונלה. זה כבר דווח בעבר כי inhibition של גנים autophagy הופך שכפול סלמונלה מוגבר בג elegans, וכתוצאה מכך למוות המוקדם של תולעים נגועים 10. Macroautophagy (המכונה במסמך זה כלautophagy) הוא תהליך דינמי הכולל ארגון מחדש של קרומי subcellular לעקל ציטופלסמה ואברונים למסירה הליזוזום לפירוק 12. Autophagy דווח להגביל את שכפול סלמונלה בג elegans ואצל יונקי 10,13.
ג הגנום elegans היה הגנום תאיים אוקריוטים הראשון רצף; הוא מגיב לטיפול RNAi 14-16. יתר על כן, יכול להיות מנוהל ביעילות על ידי חשיפת RNAi תולעים לבלוע חיידקים המכילים פעמיים תקועים RNA של גן המטרה, המכונה RNAi האכלת 16,17. ספריות האכלת הגנום כולו RNAi כבר נוצרו עבור RNAi הגנום הקרנת 16,18. בזאת, הפרו זיהום סלמונלהtocol בשילוב עם RNAi האכלה כדי לאפשר ג הבדיקה גנים elegans של עניין ביכולתם על מנת להגן מפני זיהום סלמונלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
סי אלגנס הוא אורגניזם מודל גנטי פשוט שאוכלת חיידקים כמקור התזונתי שלה. לפיכך, קל להחליף החיידקים שבמזון הרגיל שלו עם הפתוגן מעיים כדי לחקור את יחסי הגומלין בין ג elegans ופתוגן שנבחר. במסמך פרוטוקול מתואר לשלב זיהום סלמונלה ו-C elegans RNAi האכלת טיפול כדי לבחון …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר דיאן Baronas-ואל לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי Charles E. מידט מכללת FAU של גרנט זרע המדע ומלגות מהזדקנות הרפואית אליסון הקרן לKJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
参考文献
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. 遺伝学. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
- Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
- Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
- Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
- Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- . The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
- Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
- Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
- Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).
