In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Todos os procedimentos que envolvam o uso de animais são realizados de acordo com a legislação local. Nosso trabalho é aprovado pela UK Home Office assim como o painel de avaliação ética do Imperial College. Os procedimentos autorizados estão descritos na documentação de licença do projeto e seguir as orientações que garantem o bem-estar do animal em todos os momentos. Certifique-se a aderir à legislação em matéria de experimentação animal do país, onde o trabalho é realizado. 1. Labeling e Injection de hspCs: Células colheita, como descrito por Lo Celso 14-15. Preparar as células a uma concentração de 10 6 células / ml em PBS. NOTA: Use um hemocitômetro ou as informações fornecidas pelo classificador celular para contar as células; o número de células a ser marcado e injectado varia dependendo do tipo de célula (por exemplo mancha 10.000 – 20.000, hsc 100.000 – 300.000 HPCs); se trabalhar com menos de 10 5 células, ressuspender em 100 ul de PBS; é importante para ter as células em PBS sem soro, como soro inibe a coloração. DiD Adicionar à suspensão celular numa concentração final de 5 uM e a suspensão imediatamente vortex para assegurar que o corante não precipitar da solução e deixar de rotular as células. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C, em seguida, lavar por centrifugação a 500 xg durante 5 minutos, decantação do líquido e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de injecção IV (~ 100 – 150 ul) Ressuspender as células em 200 ul de PBS e recolher para uma seringa de insulina. NOTA: uma seringa de insulina é recomendada durante uma seringa convencional porque não tem agulha espaço morto e, portanto, permite que a administração da suspensão de células inteira para o mouse. Injectar as células num ratinho letalmente irradiados através de injecção na veia da cauda. NOTA: A irradiação tem conhecido, um impacto considerável no microambiente da medula óssea (ambos os componentes hematopoéticas e estromais), que se desenvolve ao longo time. Por isso, é muito importante para manter sincronismo consistente para irradiação, injeção de células (4 a 24 horas de irradiação para o melhor enxerto) e de imagem. Aqui irradiação é realizada de 6 horas antes da injeção e de imagem é realizado 20 horas após a injeção. Colocar o rato numa câmara quente (37 ° C) até que a veia da cauda parece vasodilatado. Mova o rato para o limitador e cuidadosamente deslize a agulha na veia da cauda. Injectar as células na veia – nenhuma resistência a injecção deverá ser encontrado. Deixar o rato S / N, de modo a permitir que as células migram para os espaços de medula óssea. 2 Preparando o mouse for Imaging Autoclave um par de pinças finas e um par de tesouras finas, bem como um capacete antes de usar e armazenar em um ambiente estéril. Certifique-se de anestésico o mais fresco possível, (0,38 ml Ketamina + 0,25 ml Medetomidine + 4,47 ml de água). NOTA: otos anestésicos aprovados, incluindo o isoflurano eo outro injetável, será muito eficaz. O coquetel descrito é para ser administrado por via intraperitoneal em 0,1 ml por 10 g de peso corporal, com recargas de 30-50 ul administrados a cada 45 minutos a 1 hora. Ligue o laser de dois fótons, se necessário, em seguida, iniciar o microscópio e software, a calibragem do palco quando solicitado. Ligue os lasers e permitir-lhes para se aquecer e estabilizar enquanto prepara o mouse para a imagem latente. Anestesiar o rato utilizando a mistura do anestésico preparada (passo 2.2) para o anestésico escolhido por meio de injecção intraperitoneal. Monitorizar o início da anestesia profunda através do pedal do reflexo agora e em intervalos regulares durante todo o protocolo. NOTA: o mouse devem ser cuidadosamente monitorizados durante o processo e se a anestesia parece estar iluminando (normalmente após 45 – 60 minutos) e depois administrar uma dose top-up (conforme detalhado no 2.2). Esperar alguma variação entre os ratos de diferentes idades e sexo. É importante para discutir o protocolo de anestesia com o seu veterinário local para assegurar sejam tomadas precauções adequadas para assegurar o bem-estar do mouse. Pincelar o topo do couro cabeludo, com etanol a 70% em um tecido, garantindo a não ficar qualquer etanol nos olhos do rato. Usando fórceps e tesouras estéreis, remover cuidadosamente a porção central do couro cabeludo para expor a área de calvária a ser trabalhada: fazer uma pequena incisão na parte de trás da cabeça entre as orelhas, levantando-se a pele com fórceps. Enquanto mantém a pele para cima, a tesoura deslize sob a pele suavemente e cortar ao longo do lado de fora da área de imagem desejada. Limpe o osso exposto com cotonete estéril umedecido com PBS estéril para mantê-lo úmido. Coloque a peça de cabeça de metal no crânio do rato pronto para a imagem latente. Misturar uma quantidade adequada de cimento dentário de um barco de pesagem, até se obter uma pasta e aplicar rapidamente para a superfície inferior do capacete que se atribuem ao sKull. Antes dos jogos de cimento, coloque o capacete sobre o crânio do mouse, certificando-se de não obter qualquer cimento dental na área de imagem, em seguida, esperar por ele para definir. Aplique uma pequena quantidade de Intrasite hidrogel que mantém o crânio úmido. Prenda o capacete para o suporte e prenda no lugar com o parafuso, assegurando que as ranhuras caber dentro dos entalhes titular. Retire o hidrogel do crânio com cotonetes estéril e limpo com PBS estéril, antes de se transferir para o microscópio. Insira o suporte para o estágio do microscópio, posicione o tapete de aquecimento sob o mouse, inserir a sonda termômetro retal e segura tudo no lugar no palco com fita adesiva. Coloque uma pequena gota de pomada oftálmica nos olhos do rato para garantir que eles não sequem enquanto sob anestesia. NOTA: o mouse não devem ser deixados sozinhos em qualquer momento durante o processo de imagem sob anestesia. <p cl. ass = "jove_title"> 3 in vivo de imagens: Pilhas de alta resolução e Time-lapse Aquisição Concentre-se no crânio através dos pedaços de olho. Preencha janela de imagem com purificada, água estéril e usando uma lente de imersão de água, abaixe-o para que ele toque a gota de água. Concentre-se no topo do crânio utilizando as oculares de microscópio, utilizando uma lâmpada externa como a fonte de luz. Posicionar a área de imagem no sutura central e mover para a parte traseira da cabeça para localizar a sutura coronária como uma posição de partida. Definir o microscópio para permitir a excitação eficaz e detecção dos fluoróforos relevantes especificadas na tabela de excitação e de emissão. NOTA: enquanto um confocal vertical Leica SP5 com uma cabeça de leitura galvanometer convencional rodando a plataforma de software LAS-AF é usado aqui, o procedimento pode ser facilmente replicado em outras plataformas microscópio / software. A lente usada aqui é a Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA blentes equivalentes ut de outros fabricantes estão disponíveis com ampliação adequada e alta NA Coloque o software em um modo de capturar duas imagens XY, bem como um Z-stack 3D e definir a velocidade de imagem a 400 Hz e resolução de 512 x 512 pixels. NOTA: a configuração e hardware aqui resultará em um campo de visão de 620 um e isso pode variar em outras plataformas. Defina o software de modo que vários canais / faixas são capazes de ser capturado, bem como assegurar que o método de coleta é definido para alterar as configurações entre as pilhas, se possível, ou entre quadros, no mínimo. Configure três configurações de captura independentes, desligando a iluminação a laser, no final de aquisição de cada pilha. NOTA: três canais será necessário para este procedimento para reduzir a interferência entre canais. Configure as definições da primeira varredura seqüencial para o sinal de osso SHG dois fótons (840 nm de excitação; 400-440 nm de emissão); abrir o obturador para o laser MP e assegurar MGanho P e deslocamento são configurados corretamente, potência do laser é de 12,5 – 25% e que o laser é ligado. Selecione um PMT apropriado como o único detector e mudar a cor para branco. Nota: Os detectores NDD com filtros apropriados devem ser utilizados para a detecção de quando o osso disponível para atingir um sinal mais claro, mais profundo. Repita o procedimento de configuração do canal utilizado para o canal de GFP para a autofluorescência combinado (543 nm de excitação; 560 – emissão de 600 nm) e fez (633 nm de excitação; 650-720 nm de emissão), sob as segundas configurações de digitalização, utilizando duas PMTs apropriadas. Mude o canal de cor para verde para a autofluorescência e vermelho para o fizeram. Nota: usando verde como o canal de auto-fluorescência permite a detecção mais fácil de células positivas quando fez os dois canais estão sobrepostos – células autofluorescentes aparecer como amarelo / laranja devido a estar em ambos os canais, enquanto que as células aparecem apenas como uma vez que eles só aparecem no vermelho DiD canal. O canal de auto-fluorescênciasó é usado para esta comparação e não é utilizado em qualquer análise final, no entanto, se o utilizador desejar, esta pode ser alterada para uma cor diferente para efeitos de visualização, para evitar a confusão com o canal de GFP. Finalmente, a instalação da terceira e última varredura para GFP (488 nm de excitação; 500-530 nm de emissão); certificar-se de que o obturador está aberto, se necessário e em seguida, defina a potência do laser da linha de laser de 488 nm a cerca de 15% ou um nível adequado para o laser a ser utilizado, selecione um PMT apropriado como o único detector ativo e alterar o seu pseudo-verde. Ativar um modo de imagem "ao vivo" para começar a digitalização de visualização do canal selecionado e ajuste de ganho do detector e Compensação da exposição ideal. Repita esse procedimento para cada varredura na janela seqüencial. Salve as configurações desses scans multi-canal para facilitar a reutilização. NOTA: esta permite ao usuário recarregar as configurações nas sessões subseqüentes. Ative captura multi-posição, conhecido como 'Mark umnd Encontrar "no software demonstrado, e redefinir os pontos de coordenadas. Digitalizar área de imagem do osso, a partir do cruzamento entre a sutura central e coronal, digitalização a profundidade da área de medula óssea usando tanto autofluorescência (pseudo cor verde) e fez (pseudo-cor vermelha) com uma imagem composta. NOTA: As células autofluorescentes estará presente em ambos os canais aparecem laranja / amarelo na imagem composta enquanto que as células marcadas aparece como o vermelho-apenas as células na imagem composta. Quando é detectada uma célula, marque-a como uma nova posição coordenada (x, y e z) no "Mark and Find 'ferramenta clicando na janela" Adicionar Novo ícone de posição no lado esquerdo da "Mark and Find" . Quando o campo de vista atual foi examinado, passar a fase a distância de um campo de visão para a esquerda / direita / cima / baixo. Repita esse processo para cada campo de visão, trabalhando gradualmente em torno de toda a área da janela de imagem para a esquerda de the sutura central, movendo-se em direção ao nariz do mouse. Uma vez que a bifurcação sutura central é à vista, passar para o lado direito da sutura e repita o procedimento a digitalização do lado esquerdo no sentido inverso (ou seja, em direção à sutura coronal). Marque as coordenadas de todas as novas células de interesse pelo "Mark and Find 'ferramenta. Quando a digitalização da janela de imagem é completo, use o "Mark and Find 'ferramenta para rever os pontos (selecione o ponto desejado e analisar cada ponto individualmente). Defina a parte superior e inferior de uma pilha Z em torno de cada célula para cada posição, (muitas plataformas de software permitirá que você execute z-stacks independentes para cada posição, o que reduz a captura de espaço vazio). Para cada ponto, o foco para cima e para baixo e definir posições Z superior e inferior para 3D captura z-stack e atualizar o ponto individual no 'Mark and Find ". Definir intervalo de Z-Stack para 5m e uma média para cada canal de varredura seqüencial para a qualidade adequada: Linha oQuadro média r. NOTA: O aumento do número de exames a média aumenta o período de tempo de aquisição. Adquirir uma pilha de referência de alta qualidade para cada ponto de interesse, iniciando todo o processo de digitalização (muitas vezes referida como 'Start' em vez de "Capture"). Nota: Esta verificação pode funcionar como uma referência para a futura imagem de alta velocidade. Após ter terminado com a digitalização de alta qualidade, activar uma definição de lapso de tempo para a captura. Nas configurações de lapso de tempo, defina o intervalo de tempo para 5 minutos e tempo total de execução para o comprimento desejado (por exemplo, 5 h). "Aplicar" estas definições para a digitalização total. NOTA: para reduzir este tempo de verificação para permitir um intervalo de lapso de tempo de 5 minutos, pode-se necessário reduzir o número de exames utilizados para cálculo da média, limitar a resolução de 512 x 512 pixels, converter a digitalização para bidirecional (com correção de fase necessário para alinhar ambas as direções de varredura), e / ou aumentar a velocidade de verificação a 600 Hz ou mais (mais de 600Hz fará com que o zoom da área de imagem para a plataforma de software demonstrado). É também importante notar que, enquanto um modo de imagiologia sequencial foi usada para adquirir uma imagem de alta qualidade pilha inicialmente, a aquisição simultânea é utilizado para aumentar a velocidade durante a imagiologia de lapso de tempo – isto pode resultar em alguma ligeira a diafonia entre canais, que coloca adicional importância na captura inicial das pilhas de referência com precisão separados. Começar de imagem (como antes, clicando no botão 'Iniciar' no software demonstrado). NOTA: certifique-se de manter o nível adequado de anestesia pela administração de mais, doses menores quando necessário, tomando cuidado para não overdose o mouse, regularmente completar a água para garantir o objetivo não secar e monitorar os sinais vitais e temperatura de aquecimento-pad por toda parte. Quando terminar, levante a lente do suporte e, em seguida, remova o suporte desde a fase de microscópio, assegurando os fios da sonda retal e hcomer tapete não estão danificados. Desaparafuse o capacete do detentor do palco e remova cuidadosamente o mouse. Abater o mouse usando deslocamento cervical e remover a cabeça-peça de metal colocando-a fora do crânio. Salve os dados em disco e transferência de servidor para posterior análise. NOTA: A peça de cabeça é de preferência feita por meio de imersão em acetona durante algumas horas e finalmente a esfregar o cimento residual fora.