从体素知识：实用指南复电镜三维数据的分割

图1显示了一个典型的工作流的三维电子显微镜细胞成像，包括电子断层扫描，FIB-SEM，和SBF-SEM。该工作流包括原始数据收集，数据对齐和重建成三维体积，通过过滤噪声降低，并且在必要时，裁剪到感兴趣的区域，以便最大限度地选择的分割软件的有效性。这种预处理的数据，然后准备进行特征提取/分割。 图2示出布置在图1中有四个不同的数据集（其将被引入进一步说明），其中两个是记录通过电子断层扫描（ 图2A，2B）树脂包埋标本的工作流程中，与来自FIB的其他两个词干-SEM和SBF-SEM，分别为（ 图2C，2D）。在图2中第1栏图像投影次（ 图2A1，2B1）和块表面的图像（ 图2C1，2D1），分别为，其在对准和重建被组装成三维体积。塔2示出了通过这样的三维体积，其在过滤（第3栏）显示出显著减少噪声并因此经常出现更脆切片。选择和种植的大三维体积到感兴趣的区域（第4列）之后，所关注（第5列）分段的特征的三维透视图，可以得到和进一步检查，彩色编码和定量分析。 一共有六个三维数据组，每个都包含一个堆栈或者通过电子断层扫描（3数据集）中得到的图像，FIB-SEM（2数据集），或者SBF-SEM（1数据集）被用于比较每一个如何四分割方法进行（ 图3）。该数据集由各种不同的研究项目，在实验室中干，从而提供AReasonably多样化的典型实验数据集。所有的数据集是由四个独立的研究人员，他们每个人都最熟悉的一个特定方法检查，他们被指控提供最佳的结果为每六个数据集。 该数据集是从样本如下：1。 图3A1-3A5：高压冷冻，冷冻干燥，取代的和树脂包埋小鸡内耳毛细胞的纤毛31，2， 图3B1-3B5：高压冷冻，冷冻取代的和树脂包埋的植物细胞壁（未发表），3。 图3C1-3C5：高压冷冻，冷冻干燥，取代的和树脂包埋内耳毛细胞kinocilium（未发表），4。 图3D1-3D5：高压力-冷冻，冷冻干燥，取代的和位于在人乳腺上皮细胞中的HMT-3522 S1腺泡，这已被培养在层粘连蛋白丰富extracell线粒体的树脂包埋块ular矩阵32,33，五图3E1-3E5：未染色的台式处理，对硫酸减速细菌生物膜树脂包埋块（在撰写中），和6 图3F1-3F5：在HMT的相邻小区的边界膜-3522 S1腺泡。 如可以从图3中可以看出，不同的分割方法可导致大多相似的结果为一些数据组的类型，但完全不同的结果，对于其它数据类型。例如，毛细胞纤毛数据组（ 图3A）中，产生合理分割体积与全部四种方法中，与由一个专家用户是最清晰的解释和测量所产生的人工抽象模型。在这种情况下，这样的模式允许对灯丝灯丝距离快速测量，计数的细长灯丝之间找到链接的密度图的丢失部分的相应的数量，以及确定到那里的标本样品制备34中受损的位置。这样的信息是困难得多用其他三个分割的方法来获得，尽管定做的自动分段提供了比单纯的基于密度的阈值更好的结果。 对植物细胞壁（ 图3B），手动模式生成似乎是最有效的在输送的顺序感的细胞壁，它没有任何的其它方法实现。然而，该抽象模型不捕获在数据集中的对象的拥挤。手动跟踪感兴趣的功能，似乎给了比基于密度和形状监督方法更好的结果。另一方面，手动跟踪是非常劳动密集的和的特征识别的边界是有些主观的。因此，自动化的方法可以优选用于分割大量精确和之间的电位折衷资源用在手动分割。 为kinocilium数据集（ 图3C），手动抽象模型生成产生干净的结果，揭示了三个微管意想不到架构在kinocilium，一个细节是在所剪切的数据随时可见的中心，但在所有其他方法丢失，大概是由于染色不均匀性。然而，该密度图的其他潜在的关键特征被错过在手动生成的抽象模型。这是因为，在主观的手工模型地层性质导致一个理想化和所观察到的实际密度的抽象化，并因此在模型形成主观解释这一事实。因此，本实施例很好地证明了抽象模型生成如何手动使人们把注意力集中在3D体积的一个具体方面。但是，选择性知觉和简化未能给予所有的蛋白质共同全面考虑mplexes存在于数据集。因此，如果目标是要显示的数据的复杂性，再一个是更好地与任何其它三个方案的提供。 在3D基质培养的乳腺腺泡（ 图3D）的情况下，实现高对比度的线粒体由所有四种方法容易分段，与特征不太令人惊奇地产生具有污染的最低量的最佳效果。手动跟踪（ 图3D3）。然而，手动跟踪是非常劳力密集的，因此使用有限的大容量。无论是密度阈值和基于形状监督自动分段提取的线粒体相当不错，而且会导致一个近乎完美的分割，如果再窍门清理受雇（ 如消除以下像素密度的特定阈值的所有对象）可用在不同的包。在这种情况下，手动抽象模型建筑物没有屈服有希望的结果，部分是因为线粒体不能容易地近似用球和棒的型号。 相对于所述细菌土壤小区/生物膜（ 图3E），三这四种方法的产率合理的结果，与手动模型生成效果不理想的，由于代表生物物体，如细 ​​菌，通过几何形状的挑战。胞附属物从细菌始发所用的自动分割的方法来检测，但不同时在手动特征跟踪。形状监督定做的自动分段可以进一步分离从细菌细胞外的功能，尽管它们具有相似的密度（数据未示出），使之易于量化甚至非常大的数据集。因为这是本来是一个非常大的数据集时，定做的自动分段清楚outcompeted所有其他的方法，但可能会从低复杂度中受益和相对稀疏分布感兴趣的对象（低拥挤）。 当检查2的真核细胞之间的界面上的组织样上下文（ 图3F），对所关注的特征只有手动跟踪产生良好的结果。自动化的基于密度的分割方法不能完全检测相邻小区之间的边界膜，甚至是定做的方法失败，部分原因是电池的形状不容易接近或等同的形状，尽管它明显成功的菌在所述生物膜（ 图3E5）。 从图3中观察到的分割方法做好对某些数据集，但不能在其他导致什么特点每个这些数据组的问题，并确定是否有可能进行分类的数据的特性，或出现于个人目标的类型他们respectiv匹配良好ê方式。本课题的系统研究还没有得到之前进行的，因此作为第一步的机构的形象特征和个人的目标进行了实证列表可以指导一个新手在他们试图找到各自的数据集的特征提取的最佳方法。 被确定为显著示于图4八个标准，并且它们可以分为两大类：（1）中固有的数据集，并在特征（2）的研究人员的个人目标和其他考虑，是较为主观，尽管同样重要。示是主要是从六个数据集绘制在图3中，与被引入三个附加数据集的例子：1（ 图4A1）是冷冻断层像拟南芥植物细胞壁的低温部分，所述第二（ 图4A2 ，4B1，4D1 </stro纳克>）是FIB / SEM数据集内耳血管纹，这是可以适合于在图3F1-3F5所示的类别，但更复杂的基本上一个高度复杂难懂的组织和第三（ 图4B2 ，4D2）是内耳毛细胞纤毛的剖视图的树脂部断层图像，类似于在Figuress 2A1-2A5和3A1-3A5纵向视图中所示的样本内容。 对的客观标准等的图像特性，类别固有的数据集4性状建议是重要的： 数据对比可以是（1）低（ 图4A1），为典型的冷冻电镜断层图像，（2）中间体（ 图4A2），例如在蜂窝式的风景与没有明确的细胞器或其他显着特征的信誉，或（3）高（ 图4A3），为的是为kinoci的情况下liary断层图像或在横截面中的纤毛，由于z方向内明显分开的丝状元件的对齐。 该数据可以是模糊（ 图4B1），具有两个紧密定位的目的，之间没有明显的界限清楚，如细 ​​胞中的组织，或脆（ 图4B2），具有清晰的边界。这部分的数据集的分辨率，这是由大约2-4相比，FIB-SEM电子断层图像的一个因素本身更高的功能。当然，更清晰的界限是可取的手动和自动分割方法为，但必不可少的一种方式。 该密度图可以是拥挤（ 图4C1）的紧密间隔的植物细胞壁成分所反映，或人烟稀少（ 图4C2）一样，都是细菌的菌落，这体现呈现的自动图像分割大大简化了分离。 密度图可以是具有完全不同的特征往往具有不规则的形状，例如周围的血管的血管纹组织（ 图4D1）或具有类似的组织良好定义的细胞器状的物体，如在横截面中的纤毛（高度复杂图4D2）。 另外要注意在所有不同的例子千差万别尺度，使得比较有点困难。 除了更客观的标准，如图像的特点，4个高度主观标准，将指导合适的路径的选择也提出： 期望的目的：目的可以是可视化的发束stereocilium在其复杂性，并确定与检查对象（ 图4E1）的形状，或创建内置在密度图的简化和抽象球和棒模型和可以快速计数几何对象的次测量（纤维长度，距离和连接数）（ 图4E2）。 的特征形态可以是高度不规则和样细胞，如细 ​​胞间相互作用的区域（ 图4F1），有点类似形状的一些变化，如线粒体（ 图4F2），或者主要是形状相同，如肌动蛋白丝和交叉复在纵方向（ 图4F3）发束链接。 利息（人口密度）的功能的比例是非常重要的，因为一个可能要段三维数据集中的所有特征，是植物细胞壁（ 图4G1），或细胞体积只有一小部分的情况下，因为是线粒体中的非均相蜂窝场景（ 图4G2）的情况。根据不同的数据集的大小和体积的需要分割的百分比，它可能是最有效的是使用手动的方法。在其他情况下，比如当一个人热衷于各种功能，根本就没有办法使用半自动化的分割方法。 另一个关键的主观标准是资源量人愿意投入到细分的过程，什么级别的保真度要求回答一个生物学问题。人们可能想要和需要量化的特征的体积参数（如尺寸，体积，表面积，长度，距离从其他特征， 等等 ），在这种情况下，更多的照顾，可能需要获得准确的定量信息（ 图4H1），或目的可能是只捕捉其3D形状（ 图4H2）的照片。在一个理想的世界里，资源是无限的，人们显然不想做出任何妥协，而是选择用户手动辅助特征提取的最准确路径。而这可以为许多数据集一起使用，在不久的将来三维卷西港岛线升是在10K的顺序由10K由10K或更高，和手动分割将不再能够在分割这么大的空间，发挥了突出的作用。根据不同的数据和其他数据的特性的复杂性，半自动化的分割可能成为必然。 在图5中，优势和局限性做了简要列出的四个细分方法。在图4中确定的个人目标和图像的特点，可以搭配每种方法进行了概述，以及。在图6中，个人目标和六个数据集的图像特征举例说明如何以分流数据，并决定最好的方法。两图5和6时，在讨论展开。 负载/ 51673 / 51673fig1highres.jpg“WIDTH =”500px的“/> 图1的工作流程生物成像重建和分析。此图表可采取以收集和由断层扫描采集的各个步骤的过程图像的概述，聚焦离子束扫描电镜和串行块面的SEM。原始数据收集的结果在二维倾斜串联或连续切片。这些2D图像集必须对准并重建为3D，则为了降低噪声和提高的所关注的特征的对比度过滤。最后，可以将数据分割和分析，最终导致3D模型。 请点击这里查看该图的放大版本。 图2。。工作流从断层和FIB-SEM数据采集后的工作流程中的每个步骤的不同的数据类型的实例是通过四个数据集（行AD）所示：树脂的嵌入式纵向剖面纤毛的彩色成像，树脂嵌植物细胞壁的彩色成像大肠杆菌的纤维素，FIB-SEM乳腺上皮细胞的线粒体和SBF-SEM 大肠杆菌细菌。通过对原始数据二维切片示于第1列，并从对准及三维重建后的数据的图像包含有以下2列3列中施加的过滤技术：中值滤波器（A3），非各向异性扩散滤波器（B3），高斯模糊（C3）和MATLAB的imadjust过滤器（D3）。对于每个数据从感兴趣（第4栏）裁剪区域设定最佳的分割的一个例子被显示为3D渲染中柱5， 比例尺 ：A1〜A3 = 200nm时，A4 = 150纳米，A5 = 50nm时， B1〜B3 = 200nm时，B4-B5 = 100纳米，C1-C3 = 1毫米，C4-C5 = 500nm时，D1〜D3 = 2毫米，D4，D5 = 200纳米。 请点击这里查看该图的放大版本。 四分割图3的应用方法，以实例的数据集六大例如数据集是由四个分段方式：手动抽象模型生成，人工跟踪，自动基于密度的分割，以及量身定制的自动分割。手动抽象模型生成是有效的嵌入式纤毛（一）彩色成像的树脂，因为其目的是建立一个模型，定量的目的，而不是提取密度。用于树脂嵌入植物细胞壁（B）中，自动化的基于密度的分割，对彩色成像化是最有效的方法，通过多片，其中以手动方式把更多的精力上的数据只有几片快速提取的纤维素。手动抽象模型生成产生的kinocilium（三）染色断层扫描微管三线，而其他分割方法也没有，但两国的自动化方法更快速提取的密度并因此首选。由于从FIB-SEM乳腺上皮细胞（D）的线粒体的形状，手动跟踪所提供的清洁的结果，而人口密度低，结合使用允许为快速分割的插值方法。考虑到需要分割的大容量，量身定制的自动分割被证明是最有效的细分SBF-SEM细菌数据（E），但两者的自动方法具有可比性。虽然费时，提取的FIB-SEM乳腺上皮细胞膜（F）的唯一方法是手动跟踪标尺。：为A1-A5 = 100nm时，B1-B5 = 100nm时，C1-C5 = 50纳米，D1〜D5 = 500nm时，E1-E5 = 200nm时，F1〜F5，酒吧= 500纳米。 请点击这里查看更大的版本这个数字。 图4目的图像特征和主观个人目标为归类（triaging）的数据集。使用数据的例子设置的特性，提出了标准，以告知为要使用的分割方法的决定。相对于目标的特性，数据可本质上具有对比度是低，中或高（A1-A3），是模糊或脆（B1-B2），隔开或拥挤的（C1-C2），并具有复杂的或简单地有组织的特征（D1-D2）。主观个人目标包括所需Ø BJECTIVE针对一个简化的模型，提取准确的密度（E1-E2），识别旋绕片材，令人费解的体积或线性形态存在利益（F1-F3）的特点，选择感兴趣的特征的高或低人口密度（G1-G2），并决定在高保真，高资源分配之间的权衡上的投资，如时间型（H1-H2） 比例尺递减的回报：A1 = 50纳米，A2 = 1500纳米，A3 = 100nm时，B 1 = 1500纳米，B2 = 200nm时，C1 = 100nm时，C2 = 200nm时，D1 = 10mm时，D 2 = 200nm时，E1 = 100nm时，E2 = 50纳米，F1-F2 = 500纳米，F3 = 50纳米，G = 100纳米，G2 = 1毫米，H1，H2 = 100纳米。 请点击这里查看该图的放大版本。 PX“/> 数据特性图5比较表格和主观目的是适用于不同的分割方法。下表汇总了每个细分方法的优势和局限性。从图4中的条件可以帮助确定哪些数据集是合适的量的分割方法。这些客观的形象特征和主观的个人目标被选为每种方法的最佳使用，但不同的组合可能会阻碍或帮助细分的效率。 请点击这里查看该图的放大版本。 图6：决策流程的效率吨分割riage数据集的方法具有不同的特点。基于特征图4强调，这张图说明了这四个标准贡献最大的为每个数据从图3中设置的最佳分割方法的最终决定权。每个数据集颜色编码，以快速跟随表示主决策过程的粗线，以及反映可能会或可能不会导致相同的方法的替代路径的虚线。该kinocilium，细菌和植物细胞壁的数据集进行分段最好用两条自动化的方法。相比之下，细胞膜和线粒体途径总是导致手动跟踪，因为它们很难特点。 请点击这里查看该图的放大版本。