Subnormothermic의 기술<em> 전의 VIVO</em> 간 스토리지, 평가를위한 관류 및 한계 간 이식의 수리

프로토콜의 개략도는 그림 1에 제시되어있다. 그림 1 연구 프로토콜은. 간 손상의 돼지 연구 설계는 심장 죽음 (DCD) 모델 후 기부를 기반으로합니다. 모든 간 혈관의 절개 한 후 심장 사망 따뜻한 이식 국소 빈혈의 45 분 뒤에 유도된다. 임상에서 기증자와받는 사람 병원 사이에 이식 전송을 시뮬레이션하기 위해 이식 감기, 듀얼 플러시 후 4 시간 동안 얼음에 저장됩니다. 냉장 후, 기관 관류의 안정성을 평가하기 위해 6 시간 동안 subnormothermic 관류이다. 이식 모델에서, 관류 시간은 에너지 저장 장치를 재충전하고 장기 생존 능력을 평가하기 위해 짧아 질 수있다. 클릭하세요 그가이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 재. 1 동물 참고 : 남성 요크셔 돼지, 30-35kg,이 연구를 위해 사용되었다. 모든 동물은 의학 연구를위한 국가 사회와 '건강의 국립 연구소에서 발표 한'실험 동물의 관리에 대한 가이드 '공식화' '실험 동물 관리의 원칙'을 준수 인도적인 치료를 받았다. 토론토 종합 연구소의 동물 관리위원회는 모든 연구를 승인했다. 2 오르간 검색 관류 / 이식 전에 1 주간 연구 시설 하우스 남성 요크 피그 응력 레벨을 줄이고 하우징 조건 동물 익숙 할. 시설 내부 하우징 미만 이일은 관류의 결과 (22, 23)을 변경할 수 있습니다 스트레스에 의한 신체적 반응으로 이어질 것입니다. 돼지를 마취케타민 (25 ㎎ / ㎏), 아트로핀 (0.04 밀리그램 / kg), 및 미다 졸람 (/ kg 0.15 mg)의 혼합물의 근육 내 (IM) 주사. 삽관 이전에, 돼지는 5 % 이소 플루 란을 투여 O 2의 자발적이 L 통풍 확인합니다. 성대 경련을 방지하기 위해 삽관 전에 2 % 리도카인 2 분으로 성대 스프레이. 예를 들면, 35kg 돼지에 대해 6.5 FR을 사용한다. 기관 튜브. 실내 공기의 3-5 ML로 기관 튜브를 차단합니다. 삽관 후, 정확한 삽관을 확인 capnometry를 사용합니다. 2 %에 이소 플루 란 가스를 낮 춥니 다. 14-16 호흡 / 분 및 10 ㎖ / kg 체중의 호흡량에 인공 호흡기를 설정합니다. 링거 락 테이트 용액의 주입 (시간 당 200 ㎖) 할 수 있도록 귀 정맥 중 하나에 20 G의 정맥 주사 (IV) 카테터를 배치합니다. 그런 돼지를 문질러 멸균 커튼으로 커버. 왼쪽 측면 확장 다음에 중간 선 절개를합니다. 크고 작은 창자를 커버하고 왼쪽으로 이동하기 위해 수건을 사용합니다. 별도의 infe대한 뛰어난 대정맥 (IVC)과 서로 원위부 대동맥; 뒷면 결찰 대동맥 분기; 분리 및 부착 조직에서 무료로 신장 동맥. falciforme 인대와 소작을 사용하여 삼각 인대를 나눈다. 췌장 및 포털 정맥 사이의 복막 절개하여 문맥을 놓습니다. 포털 정맥 췌장에서 배출 정맥을 묶어. 문맥 아래 복강 트렁크를 해부하고 대동맥에 거꾸로 따릅니다. 2-0 넥타이 장간막 동맥을 묶 지점 후방 복강 트렁크에 비장 왼쪽 위 동맥을 둘러싸고 있습니다. 문맥 오프 복강 트렁크를 해부하다. 림프 누출을 방지하기 위해 hepatoduodenal 인대 내 림프관을 결찰. 관계 사이 오른쪽 위 동맥을 나눈다. 작은 혈관을 결찰. 인대에서 담관을 분리하고 원심 결찰 후 나눕니다. 마음과 복강 조원 사이의 다이어프램 뒤에 대동맥 해부UNK; 대동맥 주위에 2-0 동점을 배치합니다. 전기 소작을 사용하여 우측 하부 대정맥으로부터 간을 해제; 정맥과 간 사이의 상단 부분에 가위를 사용합니다. 담낭을 제거하고 담낭 침대에서 블 리더를 소작. 헤파린의 정맥 1,000 IU / kg 기증자의 체중을 관리 할 수​​ 있습니다. DCD 모델의 경우, 헤파린 투여 후 40 mval의 KCl 3 분의 intracardial 주사로 심장 마비를 유도한다. 따뜻한 허혈의 시작점으로 설정 심정지. 관류를 들어, 즉시 심장 죽음 이후 CPDA 가방에 돼지 피 1.6 L (구연산, 인산, 덱스 트로 오스, 아데노신)를 수집합니다. 부드러운 스핀 (브레이크없이 2000 XG)를 수행합니다. 플라즈마 멸균 조건 (바이오 안전성 캐비닛 클래스 II)에서 버피 코트를 제거하고 수혈에 대한 CPDA 가방에서 적혈구를 저장합니다. 장기 플러시 라인 Cannulate 포털 정맥과 대동맥. 대퇴, 신장, 비장, 장간막, 그리고 왼쪽 위 아트 주위에 이전에 설정 한 관계를 묶어즈뿐만 아니라 상부 대동맥. 심장 박동 기증자 (HBD) 모델의 경우 심장 박동 상태에서 대동맥과 포털 정맥 삽관을 수행합니다. 45 분 따뜻한 허혈 후, 대동맥 (압력 가방) 및 포털 정맥 (구동 중력)을 통해 듀얼 관류를 사용하여 위스콘신 대학 (UW) 솔루션 간을 세척하십시오. 긴 나머지 모든 혈관을 떠나, 돼지에서 간을 잘라. 백 테이블 작성 중에 Satinsky 클램프 및 문맥 유출이 깨끗해질 때까지 역행 저급 IVC 통해 간보기 UW 용액 0.5 L와 두 번째로 세척하여 상부 IVC 클램프. 대동맥과 복강 트렁크에서 모든 동맥 가지를 묶어. UW 용액의 약 0.5 L와 동맥 다시 테이블 압 관류를 수행합니다. UW 용액을 사용하여 담관 플러시. 루어 잠금 장치와 2 "X 8"감속기를 사용하여 IVC의 상단과 하단 부분을 Cannulate; "3/8 사용 간문맥 간 동맥 cannulate; 루어 잠금과 X 4 "와 4"X 8 "감속기. 정맥 배수와 상부 및 하부 대정 맥을 사용합니다. , 장기 백에 간을 배치 기관 가방을 닫고, 재관류가 시작 될 때까지 얼음에 간을 저장합니다. 3 예 생체 간 관류 2,000 ml의 스틴 용액 함유 관류 액을 제조, 400 ㎖의 적혈구는 550 mg의 피루브산 나트륨을 100 ㎖의 아세트산 용액 (10 % Travasol), 10 mg의 칼슘 글루코 네이트, 1000 IE 신속한 작용 인슐린, 1g의 세파 졸린, 500 mg을 metronidazol을 아미노 세정 10,000 IU의 헤파린. 혈관 확장, 면역 억제, 활성 산소의 소거, 또는 특정 연구 프로토콜에 따른 간세포 치료를 위해 다른 분자를 추가한다. 투석 성분 들어, 표준 3.5 mM의 칼륨, 25 mM의 수소 나트륨, 27 mM의 포도당을 함유하는 투석액뿐만 아니라, 275 밀리그램 / L 피루브산을 사용한다. 관류 회로 (스키마는 그림 2 참조)를 설정합니다. 그림 2 회로가 설정합니다. 시작과 끝 지점으로 주 저장에서 오는, 관류 액을 형산을 통해 원심 펌프에 의해 구동된다. 오른쪽 용액 산소화 후, 회로는 전해질 항상성위한 투석기 실행 유닛에 작은 라인으로 나눠서 큰 라인은 잔여 백혈구 (WBC)의 감소를위한 백혈구 필터에 실행. 투석기를 통해 실행되는 솔루션은 주요 저수지로 돌아갑니다. 백혈구 필터 후, 회로는이 동일한 라인으로 다시 분할한다. 한 줄은 간 동맥 관류에 직접 대동맥에 높은 압력 (약 60 mmHg로)에서 실행됩니다. 다른 라인은 제 탱크로 배수한다. 이 저수지에서 포털 정맥 관류한다. 포털 관류의 압력은 (2-6 mmHg로 주위) 저수지의 솔루션 수준의 고도의 에너지에 따라 달라집니다. 모든 유체는 박사입니다인프라 및 다시 주 저장에의 것 – 간 정맥을 통해 ained. 중력 감소 및 균일 관류를 들어, 간은 온도 조절 물이 가득 풀에 배치됩니다. 그것은 불 투과성 막에 의해 수분이 분리하고 관류 서스펜션에서 수영됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 3 L 저수지 (주 저장)의 회로에서 모든 유체를 수집하고 유출을 고정. 상업 형산 다음에 원심 펌프 유출을 연결합니다. 형산 뒤에,이 라인에 튜브를 분할. 투석기에 한 줄을 연결하고 메인 탱크로 다시 배출. 백혈구 감소 필터로 두 번째 줄을 연결합니다. 간동맥에 관류 액을 공급하는 동맥 선으로 백혈구 감소 필터 후의 라인과 포털 V를 분열중력에 의한 유출 간문맥으로 빼낸 제 저장조에 관류 용액을 제공 enous 라인. 포털 유입 클램프. 유체 기억의 메인 탱크로 배출 대정맥 라인에 동맥 라인을 연결합니다. 복수 또는 간에서 관류 액의 누출의 수집을 위해, 주 저장에 연결된 흡입 라인을 준비한다. 주요 저수지에서 유출 클램프를 해제하고 관류 용액으로 회로를 채 웁니다. / 분 1,500 원에서 원심 펌프를 시작합니다. 관류 솔루션은 메인 탱크로 다시 대정맥 라인에 동맥 라인을 통해 구동됩니다. 모든 공기가 회로를 구동되어 있는지 확인합니다. 형산에 대한 가스 공급을 켭니다. 얼음 떨어져 간을 가져 가라. 식염수를 사용하여 UW 솔루션을 세척하십시오. 피하기 위해 이상적 무중력 환경에서, 선박에 대한 액세스를 용이하게하기 위해 아래로 볼록면이 배치 간접촉면에서의 장기 압축. 열 및 냉각 가능한 수조를 사용합니다. 20 ° C에 회로 물 목욕의 시작 온도를 설정합니다. 불 투과성 막으로 물 목욕을 덮고 그 막에 간을 배치합니다. 관류 용액으로 간을 잠수하여 중력 중심의 압축을 줄일 수 있습니다. 1,000 원 / 분으로 원심 펌프의 속도를 줄이고 동맥과 대정맥 라인의 연결에 두 클램프를 배치합니다. 그리고, 클램프 사이에서 튜브를 절단. 삼 방향 커넥터를 사용하여 두 카바 유출 가입 및 대정맥 라인에 연결. , 동맥 라인에서 클램프를 풀어 거품을 제거하는 동맥 정맥으로 관류 액을 부어 정맥에 선을 연결합니다. / 분 1,500 원에 원심 펌프를 높입니다. 대정맥 라인에서 두 번째 클램프를 해제합니다. 를 채우기 위해 포털 혈조로부터 클램프 해제. 관류 용액 포털 cannu 쏟아지는하자라와 연결합니다. 포털 저수지에서 안정적인 유체 수준의 특수주의하십시오. 동맥, 포털 및 대정맥 캐 뉼러의 루어 잠금 압력 라인을 연결합니다. 생리적 조건을 모방하려면 오른쪽 용기에 치료를 적용 할 수 있습니다. 증가 포털 정맥 글루코오스 그라데이션을 흉내 및 글리코겐 합성을 유도 24,25 구배를 확립하기 위해 동맥 라인에 간문맥으로 포도당을 주사하지. 회로에 간을 연결 한 후, 60 분 이내에 33 ° C까지 온도를 상승. 40 mmHg로에서 약 250 ml / 분에서 동맥 시작 흐름을 목표로합니다. 압력이 70 mmHg로까지 증가되면 이것은 재관류 동안 700 ㎖ / 분에 도달 할 수있다. 개시 온도에서 3-5 mmHg로에서 500-600 ㎖ / 분의 간문맥 흐름 목표. 온도를 상승 후 4-6 mmHg로에서 1,100 ml / 분까지 증가 포털 정맥 흐름을 모니터링 할 수 있습니다. physiologica 이상 초과 포털 압력을 피하십시오리터 값 (8 mmHg로 주위는) 사인 fenestrations (26)를 보호 할 수 있습니다. 장기 손상을 방지하기 위해 / 분 2,000 ml의 위 전체 유량을 초과하지 마십시오. 기능적 유출 폐색에 의한 간 혼잡을 방지하는 주 저장을 낮추어 -2 mmHg로로 유출을 설정한다. 소정의 값 (27)에 관류 액을 평형화하기 위하여 투석 회로에 구성 요소를 추가한다. 500 ㎖ / 시간에 투석 흐름을 설정합니다. 관류 액을 희석하지 않고 집중되어 둘 수 있도록 투석 유출을 조정하는 특별한주의를 가져 가라. 관류의 첫번째 시간 내에서 주 저장주의 깊게 관찰해야합니다! O 2 (95-98%) 및 CO 2 (2~5%)의 주 가스 혼합물 성분을 이용하여 장기의 기능을 회복하고 유지하기 위해 조직의 균질 산소화를 확인. 간은 신진 대사와 관류 동안의 pH가 수요를 변경하기 때문에 관류하는 동안 변수 가스를 사용합니다. 개시시 낮은 pH를 유지관류 역설 산도 개념 28을 사용하여 기관을 보호 및 UW 용액에 보존 후의 때문에, 재산 소화 하에서 생리적 pH가 빠른 연결 발생할 수 심각한 조직 손상을 방지하기 위해, 기관 (7) 아래 acidotic pH가 CO의 분압을 조정 갖는다 이 지속적으로 25 ~ 30 mmHg로 아래로 pH는 1 시간 내에 생리적 수준에 도달 할 수 있도록. 관류 용액에 중탄산 표준의 생리적 농도를 달성하기 위해 회로에 중탄산 나트륨 – 또는 칼륨을 추가한다. 조심스럽게 반복적 인 혈액 가스 및 전해질 제어를 주입한다. 정기 정맥 및 동맥 혈액 가스 및 AST 분석하여 관류를 모니터링합니다. 정맥 PO 2 재관류 동안 175 mmHg로 위에 남아있다. 혈관 흐름과 압력을 모니터링하고 일정한 혈관 저항에 의해 안정된 혈류를 확인합니다. 8 시간까지 안정 관류 시스템을 유지합니다. 생체 외 관류 기간 말에, 쿨20 ° C로 관류 시스템 다운 및 간에서 회로의 튜브를 분리 한 후, 차가운 얼음 UW 용액으로 이중으로 간을 관류 액을 세척하십시오. 다시 한 번 멸균 장기 가방에 얼음에 배치 간을 저장합니다.