Колориметрический бумажной основе Обнаружение<em> Кишечная палочка</em>,<em> Сальмонелла</em> SPP., И<em> листерий</em> Из больших объемов воды для сельского хозяйства
概要
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
Этот протокол описывает быстрое колориметрического обнаружения кишечной палочки, бактерии рода сальмонелла., И листерий от больших объемах (10 л) сельскохозяйственных вод. Здесь вода фильтруется через стерильный модифицированных Moore мазков (MMS), которые состоят из простого марлевый фильтр, заключенный в пластмассовый картридж, чтобы сконцентрировать бактерии. После фильтрации неселективные или селективные обогащения для целевых бактерий выполняются в MMS. Для колориметрического обнаружения бактерий-мишеней, что обогащение затем анализировали с использованием бумажных аналитические приборы (μPADs) со встроенными бактерий-индикативные субстратов. Каждый субстрат реагирует с целевым показателем-бактериальных ферментов, генерируя окрашенные продукты, которые можно обнаружить визуально (качественного определения) на μPAD. Кроме того, цифровые изображения прореагировавших μPADs могут быть получены с общим сканирования или фотографических устройств и проанализированы с помощью ImageJ программного обеспечения, AlLowing для более объективной и стандартизированной интерпретации результатов. Хотя биохимические процедуры скрининга предназначены для выявления вышеупомянутых бактериальные патогены, в некоторых случаях ферментов, продуцируемых фона микробиоты или деградации колориметрических подложек может привести к ложным положительным. Таким образом, подтверждение с использованием более дискриминационный диагностики необходим. Тем не менее, это бактериальная концентрация и обнаружения платформа стоит недорого, чувствительны (0,1 КОЕ / мл предел обнаружения), легко выполнить, и быстрый (концентрация, обогащение, и обнаружение выполняются в течение примерно 24 часов), оправдывая его использование в качестве первоначального метода скрининга для микробиологического качества сельскохозяйственной воды.
Introduction
Важно, чтобы возбудителей болезней пищевого происхождения быстро и предпочтительно обнаружены в полевых условиях на основе в целях снижения бремени болезней пищевого происхождения. Общие стратегии для выявления пищевого происхождения бактериальные патогены включают биохимический профилирование, селективный и дифференцированного культивирование, иммунологическую изоляцию и обнаружение, и молекулярный обнаружения. Однако эти методы препятствуют спорадической загрязнения, небольшие размеры выборки проверенные, зачастую низкие концентрации пищевого происхождения патогенных бактерий, требуют длительного времени для обработки, и / или не применимы для полевых условиях. Кроме того, соединения во многих пищевых матриц ингибирующее к обнаружению и диагностических применений. Для того, чтобы повысить вероятность микробного обнаружения, США пищевых продуктов и медикаментов предположил, что тестирование сельскохозяйственной воды (например, воды для стирки и воды для орошения), которые либо вступает в контакт с большой площадью поверхности свежих продуктов или служит средством для рзагрязнение roduce является жизнеспособной альтернативой прямого тестирования пищи 1. Тем не менее, часто низкий естественный возбудитель-нагрузка в сочетании с эффекта разбавления представительного сельскохозяйственной пробы воды делает Методы подготовки образца для концентрации патогенов важное значение. Такой способ требует выборки больших объемов воды (≥ 10 л), адекватной патогена-концентрации, и совместимость с последующих стратегий обнаружения.
Модифицированные Мур тампоны (MMS) недорогие, простые и прочные устройства, используемые для концентрации бактерий из больших объемах (≥ 10 л) воды 2-4. MMS состоит из пластикового кассеты, заполненной марли, который служит в качестве фильтра грубой очистки для больших объемов воды прокачивается через кассету с использованием перистальтического насоса. MMS является недискриминационный метод концентрации бактерий (≥ концентрации в 10 раз), которая фиксирует органические и неорганические частицы материала в том числе микроорганизмов в обрабатываемой LiQuid образцы. Вполне вероятно, что отлично эффективность концентрации целевых микроорганизмов со стороны MMS можно объяснить тем, что микроорганизмы, как ожидается, быть присоединены к ил-глинистой фракции или органических микро-агрегатов взвешенных твердых частиц 3. Прочная конструкция из MMS позволяет для преодоления большинство недостатки, связанные с другими методами фильтрации для захвата и концентрации бактерий из воды, таких как засорение фильтров, неспособность обрабатывать большие объемы, образцов фильтров с высокой мутности и высокой стоимости. По этим причинам, FDA рекомендует, чтобы MMS'S быть включены в официальных процедур процедур сбора проб окружающей среды и производить связанных 5.
Здесь описан способ для концентрации, обогащения и обнаружения кишечной палочки, бактерии рода сальмонелла., И листерий из сельскохозяйственных вод. MMS используется для концентрации BactEria, а также служит в качестве емкости для селективного или неселективного бактериального обогащения. Бактериальный обнаружения достигается биохимически с помощью бумажных аналитические приборы (μPADs) 6. μPADs могут быть изготовлены как жидкостных сетей или местная испытаний с использованием различных методов, включая фотолитографии, струйной печати, тиснения и воск печати 7-11. Примеры жидкостных конструкций могут быть дендритные структуры канала, где образец, размещенные в центре, а затем течет в дистальных водоемов или отдельных канальных картин, в которых образец или субстрат вытащил из внешних водоемов канала под действием капиллярных сил в центр 12. Для этого протокола, мы решили использовать для 7-мм диаметра воск-бумажной пятна массивов вложенных с хромогенных субстратов, которые могут быть обработаны ферментами свидетельствует о тестируемых микроорганизмов здесь: Хлорфенол красный β-D-галактопиранозида (CPRG) и 5 - бром-4-хлор-3-индолил β-D-глюкуронида (X-Gluc)для обнаружения β-галактозидазы и β-глюкуронидазы производимого Е. палочка; 5-бром-6-хлор-3-индолил каприлат (пурпурный каприлат) для обнаружения С8-эстеразы производимого сальмонелла.; и 5-бром-4-хлор-3-индолил-мио-инозит фосфат (X-InP) для обнаружения фосфатидилинозитол конкретных фосфолипазы С (PI-PLC) получают путем L. моноцитогенес 6. Таким образом, наличие определенной бактерии можно наблюдать визуально без необходимости в сложном оборудовании или интерпретации данных. Специфичность и чувствительность фермента на основе колориметрического обнаружения μPAD этих конкретных целевых бактерий была исследована ранее 6. Кроме того, чувствительность метода интегральной концентрации обнаружения для этих целевых бактерий оценивали пики больших объемов воды с заранее определенных уровней микроорганизмов (неопубликованные данные и Bisha соавт. 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает интегрированный способ обнаружения E. палочка, сальмонелла., Л. моноцитогенес в сельскохозяйственном воды. Здесь концентрация MMS бактерий из больших объемов (10 л) сельскохозяйственной водой, соединен с бактериальным обогащения, и бактериально-колориметрич?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
参考文献
- . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , (2012).
- Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).
