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神経科学

Topo romboencefalo<em> Ex Vivo</em> Cultura per studiare la migrazione Branchiomotor Neuron viso

Published: March 18, 2014
doi:
10.3791/51397
, ,
1UCL Institute of Ophthalmology,University College London, 2Department of Human Immunology,Centre for Cancer Biology, South Australia

概要

Neuroni embrionali sono nati nella zona ventricolare del tubo neurale, ma migrano per raggiungere obiettivi adeguati. Branchiomotor facciale (FBM) i neuroni sono un modello utile per studiare la migrazione neuronale. Questo protocollo descrive la wholemount ex vivo cultura della hindbrains embrione di topo per studiare i meccanismi che regolano la migrazione FBM.

Abstract

Neuroni embrionali sono nati nella zona ventricolare del cervello, ma poi migrare verso nuove destinazioni per raggiungere obiettivi adeguati. Decifrare i segnali molecolari che guidano cooperativo migrazione neuronale nel cervello embrionale è quindi importante capire come le reti neurali complesse formano che supportano più tardi la vita postnatale. Branchiomotor facciale (FBM) neuroni del topo hindbrain embrione migrano da rhombomere (r) 4 caudalmente a formare i nuclei facciali appaiati nella regione r6-derivati ​​del hindbrain. Qui forniamo un protocollo dettagliato per wholemount ex vivo cultura della hindbrains embrione di topo adatti per studiare le vie di segnalazione che regolano la migrazione FBM. In questo metodo, hindbrains di embrioni di topo E11.5 vengono sezionati e coltivate in una preparazione libro aperto su inserti di coltura cellulare per 24 ore. Durante questo periodo, i neuroni FBM migrano caudalmente verso r6 e possono essere esposti ad anticorpi funzionali-blocking e piccola molecules nei terreni di coltura o perline eparina carichi di proteine ​​ricombinanti per esaminare i ruoli per le vie di segnalazione coinvolte nel guidare migrazione neuronale.

Introduction

Neuroni embrionali sono nati nella zona ventricolare del cervello, ma poi migrare verso nuove mete da raggiungere adeguate aree di destinazione che si trovano a grande distanza. Il corretto posizionamento dei corpi cellulari neuronali in punti appropriati lungo gli assi dorso-ventrale e antero-posteriore del cervello di sviluppo è essenziale per il corretto cablaggio, la sopravvivenza e la funzione di questi neuroni dopo la fase migratoria 1-4. Simile ai meccanismi molecolari che controllano l'assone guida 5-7, serie combinatorie di spunti attrattive e repulsive sono pensati per guidare i neuroni migrano 1,8. Tuttavia, a causa delle interazioni tra più tipi di cellule, i segnali che controllano la migrazione neuronale sono stati ampiamente studiati meno di quelli coinvolti nella guida degli assoni, che può essere studiato cellule autonomamente. La hindbrain sviluppo dei vertebrati è stato utilizzato in diversi studi recenti per comprendere i meccanismi molecolari e cellularidella migrazione neuronale, per esempio in pulcino, mouse e zebrafish 1-4,9. Questo organo contiene diversi tipi di neuroni, tra cui diversi sottotipi di precerebellar e motoneuroni 5,7,10,11.

Motorneuron hindbrain sono nati nella zona ventricolare vicino al fondello, e differenziarsi in specifici sottoinsiemi in base alla loro rhombomere di origine 1,12. Il branchiomotor facciale (FBM) i neuroni sono generati in rhombomere (r) 4 nel hindbrain ed estendono i loro assoni dorsale attraverso un punto di uscita r4 nel secondo arco branchiale per innervare i muscoli facciali 2,9,13. FBM neuroni di zebrafish ei topi fornire eccellenti modelli per studiare i meccanismi molecolari e cellulari della migrazione neuronale in un processo che viene prontamente visualizzato, perché questi neuroni riproducibile traslocano loro somata in un processo spatiotemporally ben definito. Nei topi, i neuroni FBM primo migrano Caudally attraverso R5 e poi sia caudale e ventrale per raggiungere la loro posizione definitiva sul lato piale del hindbrain nel territorio di r6, dove si formano i nuclei appaiati del VII nervo cranico (VIIn) 10,11,14. In zebrafish, i neuroni FBM inizialmente migrano ventrale e poi cambiano direzione al confine R4-R5 per continuare la migrazione verso la superficie piale in maniera laminina-dipendente 4,12,15,16. Questa migrazione procede nel corso di un periodo di diversi giorni di sviluppo e può essere diviso in fasi di migrazione tangenziale e radiale, che permette l'identificazione di molecole che mediano questi due processi distinti. Al contrario, i neuroni FBM del pulcino hindbrain embrionale rimangono in r4 3,13,17-19.

Durante la loro migrazione, i neuroni FBM possono essere identificati, come altri tipi o motoneuroni, attraverso la loro espressione del fattore di trascrizione homoeodomain isolotto 1 (Isl1) 14. Così, commercemount immunofluorescenza o ibridazione in situ per questo indicatore a diversi stadi di sviluppo rivela il flusso migratorio distinto di FBM somata estende da R4 a R6 in zebrafish o il mouse 4,15,16. Inoltre, i giornalisti transgenici fluorescenti come Isl1-GFP sono state utilizzate come strumenti idonei per visualizzarne la migrazione dei neuroni FBM in zebrafish 3,17-19. Oltre alla loro idoneità per l'imaging, molti ricercatori hanno studiato la migrazione dei neuroni FBM nello sviluppo di zebrafish, perché i loro embrioni a vita libera possono essere manipolati facilmente con tecniche di trapianto cellulare e composti farmacologici applicati direttamente l'acqua dell'acquario. Al contrario, l'embrione di topo sviluppa racchiuso in utero, precludendo l'impianto di perline che trasportano segnali di orientamento o la somministrazione di anticorpi funzione di blocco che non attraversano la barriera placentare. Inoltre, i composti farmacologici somministrati alla madre in gravidanza possono avere ONUeffetti collaterali desiderati che possono indirettamente compromettere l'embriogenesi. Eludere questa limitazione, abbiamo sviluppato un metodo di coltura ex vivo per l'intera hindbrain del mouse che è compatibile con la migrazione FBM neurone e la sopravvivenza per 24 ore dopo dell'espianto 7,16. Questo metodo permette la manipolazione farmacologica facile, impianto di perline trasportano segnali o somministrazione di anticorpi funzionali bloccante orientamento e potrebbe anche essere adattato per studiare la migrazione di altri sottotipi neuronali nel hindbrain a diversi stadi di sviluppo.

Protocol

1. Facoltativo: Prepara Affi-gel Beads Perline eparina (Gel) per FBM Assay attrattività NOTA: Preparare perline gel almeno 1 giorno prima di iniziare la procedura di espianto. Lavare 100 microlitri gel eparina sospensione di sferette con PBS sterile per 20 minuti su un rullo a temperatura ambiente (RT). Perline pellet in una centrifuga da tavolo per 5 min a 13.000 x g. Aggiungi PBS sterile e ripetere la procedura di lavaggio 4x. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere PBS e immergere le perle in un piccolo volume di una soluzione sterile contenente la proteina ricombinante di scelta, avendo cura di coprire le perline con la soluzione. Questo protocollo utilizza 100 ng / ml VEGF165 umano ricombinante in PBS per riprodurre un esperimento pubblicato in precedenza 16. Incubare le perline gel eparina con la soluzione di proteina ricombinante per un minimo di 12 ore e un massimo di 1 settimana su un rullo a 4 ° C. 2. Rivestimento della Cultura Inserts Espianti hindbrain sono coltivati ​​sulla cultura Corning inserisce con una dimensione dei pori 8 micron, o inserti equivalenti. Inserti di coltura possono essere riutilizzate dopo il completamento del protocollo, a condizione che siano lavati con acqua distillata, sterilizzati con etanolo, e conservati in etanolo al 70% fino a quando necessario. NOTA: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in una cappa a flusso in condizioni sterili. Preparare terreni di coltura espianto costituito Neurobasal mezzo supplementato con B27 (20 microlitri / ml), glucosio (6 mg / ml) e penicillina / streptomicina (5 mg / mL). Cultura Wash inserisce con PBS sterile per 5 min e asciutto per 5-10 min sotto la cappa a flusso. Mettere un inserto cultura in ogni singolo pozzetto di una piastra 12well. Nota: gli inserti possono avere bisogno di una piccola spinta per adattarsi perfettamente nel pozzo. Coprire gli inserti culturali con 10-20 mcg / ml topo laminina in Neurobasal medie e metterli in un tessuto culturale incubatore (37 ° C, 5% CO <sub> 2) per 1 ora. Nota: rivestimento deve essere effettuata al momento della dell'espianto. 3. La dissezione del Hindbrains da E11.5 embrioni di topo Abbattere cronometrato femmina incinta mouse con una procedura eticamente approvato il giorno embrionale (E) 11.5 e posizionare l'utero contenente gli embrioni in un piatto di plastica 100 millimetri con terreno L15 ghiacciata. NOTA: Tutti i passi dissezione devono essere eseguite in L15 ghiacciata. Utilizzando un microscopio da dissezione e Dumont orologiaio PINZA numero 5, strappare la parete muscolare dell'utero per esporre gli embrioni, rilasciare ogni embrione, recidere il cordone ombelicale, e con attenzione rimuovere il sacco vitellino. Usando una pipetta Pasteur di plastica con apertura wide-bore, trasferire ogni embrione in un piatto di plastica pulita con L15 ghiacciata. Utilizzando pinze Dumont, decapitare l'embrione appena sopra le zampe anteriori. Se l'esperimento richiede genotipizzazione degli embrioni, raccogliere campioni di tessuto per l'isolamento del DNA genomico (ad esempio un piccolo piece del sacco vitellino o di coda punta 16,20). Girare il lato dorsale testa e identificare il 4 ° ventricolo, che è coperto da uno strato di tessuto sottile (Figura 2B). Perforare con attenzione il roofplate e cominciare a sbucciare via caudalmente lungo la linea mediana sopra il hindbrain posteriore e il midollo spinale, e rostralmente sopra il mesencefalo. Il hindbrain dovrebbe ora essere esposta (Figura 2C). Stuzzicare delicatamente via il mesenchima testa rimanente e tutte le meningi che sono attaccati al lato piale del hindbrain (Figura 2D). Rimuovere il tessuto del midollo mesencefalo e midollo in modo che il hindbrain dispiega e possono essere piatte in un preparato libro aperto (Figura 2E). Utilizzando un ampio tunnel di plastica pipetta Pasteur, trasferire ogni hindbrain sezionato ad una piastra a 12 pozzetti contenenti ghiacciata L15 e memorizzarli sul ghiaccio finché non sono stati sezionati tutti hindbrains. Utilizzando un ampio tunnel di plastica pipetta Pasteur, trasferire un peccatogle hindbrain a un piatto vuoto, mantenendo una preparazione libro aperto, lato ventricolare alto, in una goccia di approssimativa di 100 microlitri L15. Trasferire alcuni microlitri delle perle gel eparina incubate alla stessa gocciolina. Nota: Poiché le dimensioni di perle sono variabili, si consiglia di trasferire circa 10 perline e quindi scegliere una dimensione ottimale per il trapianto nel cervello posteriore. Fare un piccolo strappo nel tessuto hindbrain e inserire delicatamente 1-3 perle di gel nel tessuto hindbrain a livello di r5 / 6, circa a metà strada tra la linea mediana e il bordo laterale del hindbrain, abbassandoli nel tessuto in modo che la tallone è posizionato appena sotto la superficie hindbrain. NOTA: La procedura di dissezione può prendere tra 5-20 min / hindbrain, a seconda dell'esperienza, e può allungare per un lungo periodo se cucciolate sono di grandi dimensioni, in ogni caso, hindbrains dovrebbero essere in cultura non più di 3 ore di post-mortem per bene risultati. 4. HindbrainEspianto Cultura Rimuovere la piastra contenente gli inserti culturali dal termostato, aspirare la soluzione di rivestimento laminina. Mettere un inserto cultura in una capsula di Petri separato riempito di ghiaccio freddo L15 e, utilizzando un ampio tunnel di plastica pipetta Pasteur, trasferire ogni lato ventrale hindbrain su sopra l'inserto cultura (Figura 2G). Il hindbrain dovrebbe trovarsi completamente pianeggiante sulla membrana inserto. Sollevare delicatamente l'inserto cultura dal piatto e tamponare più volte su carta velina pulita per rimuovere il liquido in eccesso. Questo processo assicura che la hindbrain aderisce l'inserto cultura in un piatto, preparato libro aperto. Se il hindbrain si rannicchia, il suo tessuto può irreversibilmente crescere insieme. Riempire il 12-pozzetti originale con 500 microlitri terreni di coltura preriscaldata e posizionare l'inserto posteriore in questo pozzo. Regolare accuratamente il volume con un altro 400-600 ml di mezzi per coprire solo il hindbrain, assicurando che il hindbrain non galleggiala membrana. Se galleggia, tornare al punto 4.4 e ripetere fino a quando il hindbrain rimane attaccato alla membrana. In questa fase, è possibile aggiungere inibitori biologici di interesse ai media per studiare il loro effetto sulla migrazione dei neuroni FBM. NOTA: Se l'impianto di perline o di gestione di altri trattamenti, si consiglia di mantenere almeno due espianti di controllo in condizioni di crescita normali per esperimento al fine di garantire che l'esperimento è stato impostato correttamente. Incubare espianti per 24-30 ore in un incubatore di coltura tissutale (37 ° C, 5% CO 2). 5. Wholemount immunofluorescenza di romboencefalo espianti Aspirare il supporto da ogni pozzetto, lavare in PBS e fissare per 2 ore a 4 ° C con agitazione in ghiacciata formaldeide al 4% (preparata di fresco o appena scongelati 4% paraformaldeide disciolto in PBS). Nota: Non tentare di rimuovere hindbrain dall'inserto cultura prima del fissaggioè completa. Sciacquare 3x con PBS. Facendo attenzione le hindbrains dagli inserti cultura con pinze Dumont. Alcuni espianti sono difficili da staccare, ma di solito possono essere sollevati applicando una leggera pressione attraverso ripetutamente espellere PBS da una pipetta. Trasferire i hindbrains a 2,0 ml tubi a fondo rotondo per l'etichettatura immunofluorescenza. Permeabilize hindbrains per 30 min a temperatura ambiente (RT) in PBS contenente 0,1% TritonX-100 (PBT) con dolce rotolamento. Incubare per 1 ora a RT in PBT contenente siero di capra 10% inattivato al calore normale con delicata rotolamento. Incubare espianti con leggera rotazione a 4 ° C per 5 giorni con anticorpo primario specifico per Isl1, diluito 1:100 in PBT contenente siero di capra normale inattivato al calore 1%. Lavare gli espianti a RT 4x con PBT per 15 minuti ciascuno. Incubare espianti con leggera laminazione a temperatura ambiente per 3 ore con fluoroforo capra coniugato anticorpo anti-mouse (per esempio Alexa Fluor 488 di capra antitopo, diluito 1:200) in PBT contenente siero di capra normale inattivato al calore 1%. Lavare gli espianti 4x a RT con PBT per 15 minuti ciascuno con delicata rotolamento. Postfix gli espianti in formaldeide al 4% per 30 min a RT. Coprire un vetrino con 3 strati di nastro isolante nero e accise con un bisturi una piccola piazza del nastro a strati per creare una tasca per gli espianti, in alternativa, utilizzare un vetrino depressione. Montare ogni hindbrain in SlowFade reagente in una tasca e coprire con un coprioggetto di vetro, evitando accuratamente di intrappolare bolle d'aria e immagini utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. NOTA: In alternativa alla immunostaining, ibridazione in situ con riboprobes che riconoscono FBM (cioè Isl1 o PHOX2B) può essere utilizzato per visualizzare FBM neuroni 16,21. Sintesi dei passaggi e dei tempi Temporizzato accoppiamento di ottenere gravidanze E11.25: ~ 14 giorni Optional: Bead preparazione (Protocol 1): ~ 2 ore, il giorno prima di isolamento embrione Preparare gli inserti della cultura e dei media (Protocollo 2): ~ 30 minuti, prima di isolamento embrione Isolamento embrione e la dissezione hindbrain (passaggi 3,1-3,4): ~ 10 min / embrione Dissezione hindbrain (passaggi 3,5-3,7): ~ 5-10 min / hindbrain Procedura di espianto (passaggi 3,8-3,9): ~ 5-10 min / hindbrain Optional: cordone impianto (passi 3,10-3,11): ~ 5-10 min / hindbrain Cultura espianto (fase 4.7): 24 ore Fissazione per la colorazione anticorpale (fase 5.1): 2 ore Procedura di colorazione e di imaging (protocollo 5): 5 giorni

Representative Results

Questa sezione illustra esempi dei risultati che possono essere ottenuti attraverso lo studio FBM migrazione dei neuroni nel hindbrain mouse attraverso ex vivo della cultura. Abbiamo dimostrato che i neuroni FBM in hindbrains espiantati dal giorno 11 embrioni di topo prima subiscono una migrazione tangenziale (Figura 3A) e poi iniziare a montare il motore nuclei facciale (Figura 3B), simile al loro comportamento in utero (vedere Figura 1). Abbiamo inoltre dimostrato che l'impianto di un cordone VEGF165 imbevuto attrae neuroni FBM (Figure 3C e 3D), come precedentemente illustrato 16. È importante sottolineare che questo protocollo permette di studiare la migrazione FBM, in assenza di vasi sanguigni o fattori di vasi-derivati ​​che possono influenzare la migrazione FBM in utero, perché la vascolarizzazione nonperfused degenera nella cultura 16. Pertanto, l'etichettatura globuli aspecifica osservato quando si utilizza l'anticorpo topo Isl1 su frescoisolati hindbrains del mouse (Figura 1) non è più presente nel tessuto hindbrain dopo 24 ore di cultura (figure 3A-F). Infine, vengono mostrati due esempi di hindbrains che non sono stati espiantati correttamente e quindi contenere neuroni FBM in una distribuzione anormale, o perché hindbrain non è stato espiantato abbastanza presto dopo embrione isolamento (Figura 3E) o perché il tessuto hindbrain ripiegato al transwell ( Figura 3F). Figura 1. FBM migrazione dei neuroni confocale z-stack di hindbrains del mouse tipo selvatico dopo Isl1 immunomarcatura wholemount e flatmounting,.. Alla linea mediana hindbrain è indicato da un asterisco in tutti i pannelli (A) superficie ventricolare di un hindbrain E11.5 nel area contenente neuroni FBM Isl1-positivo (freccia), dimostrando la loro migrazione tangenziale da R4 a R6;. posizione di R4, R5 e R6 è indicato (A ') Pial superficie di una metà dello stesso hindbrain nella zona contenente la anlage . di uno dei nuclei FBM accoppiati (indicati con VIIn), così come altre popolazioni neuronali Isl1-positivo (B) superficie ventricolare di un hindbrain E12.5 contenente neuroni FBM che sta migrando tangenzialmente (freccia); la freccia indica un esempio di un vaso sanguigno contenente cellule circolanti che sono aspecifico etichettati da reazione crociata dell'anticorpo secondario anti-topo utilizzato per rilevare l'anticorpo Isl1 IgG di topo (B '). Pial superficie di una metà dello stesso hindbrain E12.5, che contiene uno dei nuclei FBM accoppiati. La linea mediana è indicato da un asterisco in ogni pannello. Bar Scale (tutti i pannelli): 200 micron. V, ventrale, P, piale./ 51397fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita. Figura 2. Mouse E11.5 hindbrain dissezione e ex vivo della cultura. (AE) passaggi chiave del protocollo di dissezione E11.5 hindbrain; barra della scala: 1. Mm (A) Testa dell'embrione dopo che è stato tagliato fuori dal resto dell'embrione a livello degli arti anteriori (B) La parte rostrale della. testa è stato rimosso e il resto del tessuto testa posizionato in modo che il 4 ° ventricolo (freccia) è orientato verso l'alto. (C) Il tetto del 4 ° ventricolo è stato staccato, e hindbrain è stata esposta da peeling tessuto sotto hindbrain distanza rostralmente e caudalmente. (D) La membrana piale è stato rimosso (si noti che in questa exampio, alcune midollo spinale cervicale (SC) tessuto è rimasto attaccato al hindbrain). (E) mesencefalo eccesso (MB) e del midollo spinale (SC) tessuto è stato rimosso per mantenere solo hindbrain. (inserti F) di coltura sono stati rivestiti con laminina e collocati in una piastra di coltura tissutale ben 12. (G) Ogni hindbrain è stato posto su un inserto e coperto con i media. (H) Rappresentazione schematica del percorso intrapreso dalla migrazione dei neuroni FBM (blu) durante la 24 ore di cultura. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita. Figura 3. Hindbrain ex vivo della cultura Mouse. (A, B) Un hindbrain E11.5 è stato coltivato per 24 ore e immunofluoresc pendentemente etichettati per Isl1 illustrare FBM migrazione neuronale in un espianto, sia ventricolare (A) e (B) piale lati hindbrain sono mostrati (C, D) hindbrains E11.5 littermate sono stati coltivati ​​in presenza di eparina tallone impiantato bagnato. in PBS (C) o VEGF165 (D); notare che i neuroni FBM migrati verso e sopra il tallone VEGF165, e il flusso di migrazione pertanto estesa ulteriormente caudalmente rispetto al lato non trattato dello stesso hindbrain o hindbrain contenente sferette di controllo (E. , F) Esempi di insoddisfacenti espianti E11.5 romboencefalo, in cui FBM non sono emigrati da R4 (E), o in cui il tessuto hindbrain ripiegato durante la coltura (F). La linea mediana è indicato da un asterisco in ogni pannello. Barra della scala (per tutti i pannelli): 200 micron. V, ventrale, P, piale."> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Discussion

Questo protocollo descrive la cultura wholemount di hindbrains topo E11.5 in un sistema transwell per studiare la migrazione dei neuroni FBM. Questo protocollo permette motoneuroni del mouse romboencefalo da tenere viva e la migrazione per un periodo di 24 ore, consentendo ex vivo manipolazione. Questo metodo presenta numerosi vantaggi sperimentali per gli investigatori cercano di identificare i meccanismi molecolari e cellulari della migrazione neuronale. Considerando saggi di migrazione tradizionali espianto piccoli pezzi di tessuto neurale in matrice su piastre di coltura e consentono l'osservazione di singoli neuroni rispondono agli stimoli esogeni, uno dei principali vantaggi del saggio transwell è la sua idoneità per manipolare i neuroni migrano all'interno dell'ambiente organo ospitante e quindi una più contesto fisiologico. È importante sottolineare che le sostanze possono essere facilmente applicati alle ex vivo romboencefalo espianti per testare il loro effetto sulla migrazione neuronale, aggirando i possibili effetti collaterali associati con administesuonare queste sostanze per un mouse incinta. Infine, il modello ex vivo permette anche la sperimentazione di sostanze che non attraversano la barriera placentare, come gli anticorpi funzione di blocco. Grazie a questi vantaggi, la ex vivo hindbrain cultura fornisce un metodo alternativo e complementare a embrioni di zebrafish, che può essere trattata con acqua piccole molecole solubili nell'acqua dell'acquario, o per elettroporazione in utero di cervelli embrionali, che richiede l'uso di speciali attrezzature ed è più difficile da padrone rispetto alla tecnica cultura qui descritta. Un altro vantaggio del protocollo qui descritto è la sua riconducibilità ad impiantare perline imbevuti di proteina ricombinante o altri reagenti, consentendo quindi l'applicazione di un metodo embrionale standard sviluppato per manipolare embrioni di pollo di un modello murino di migrazione neuronale. In particolare, il modello di coltura ex vivo può essere applicato a hindbrains di topi geneticamente ingegnerizzati difettosotiva in molecole specifiche coinvolte nella migrazione neuronale, come i recettori di crescita o fattore di orientamento, e combinato con impianti tallone per verificare se la reattività di leganti è perso. Oltre alla manipolazione farmacologica, ex vivo protocollo cultura può anche essere adattato per l'elettroporazione di vettori di espressione che potrebbero alterare l'espressione di geni di interesse; metodi appropriati per elettroporazione sono stati precedentemente descritti 22,23. Questo protocollo può anche essere adattato per visualizzarne la migrazione dei neuroni mediante microscopia time-lapse in espianti romboencefalo da topi transgenici contenenti neuroni fluorescente FBM, ad esempio Isl1-Cre, Rosa26Yfp 21. Infine, questo protocollo può essere utilizzato anche per studiare altri tipi di neuroni che migrano nel cervello posteriore, come quelle che formano la oliva inferiore, anche se ciò richiederebbe l'uso di hindbrains nelle fasi embrionali anziani e può richiedere coltura fino a 48 ore, seconda vitalità neuronale <em> Ex vivo.

Passaggi critici e risoluzione dei problemi

Per il successo di questo protocollo, è fondamentale che gli embrioni sono raccolti nella fase iniziale E11.5 giorno, più vicino al E11.25, quando FBM migrazione dei neuroni è appena iniziata. Tuttavia, non è sempre possibile raggiungere embrioni allo stadio di sviluppo a causa di variabilità naturale accoppiamento di topi, e di conseguenza, ci può essere una certa variabilità nel prolungare di migrazione FBM tra diversi esperimenti. La variabilità della migrazione FBM può osservare anche se l'esperimento non è completato entro il tempo assegnato, circa 3 ore, come si può vedere in Figura 3E. Tessuto hindbrain da E11.25 embrioni di topo è delicato. Quando dissezione e durante tutta la procedura espianto, è importante non strappare il tessuto hindbrain nelle zone di r4-r6 dove sono localizzati i neuroni FBM. A causa della natura delicata della dissprocesso ezione, e perché la velocità con cui hindbrains sono collocati nella cultura influenza il risultato, la procedura potrebbe richiedere un paio di pratica corre da padroneggiare, in particolare prima che siano utilizzati preziosi campioni o reagenti. Infine, è importante che il tessuto hindbrain viene inserito in una configurazione aperta libro sull'inserto cultura, perché ripiegamento del tessuto hindbrain durante la coltura impedirà normale migrazione FBM (vedere Figura 3F).

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MT è supportato da un dottorato di ricerca studentship [rif. 092839/Z/10/Z] e CR da una nuova Investigator Award [rif. 095623/Z/11/Z] dal Wellcome Trust.

Materials

Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) VWR 211-2120
Cell culture plates, 12 well Thermo Scientific 150628
Plastic cell culture dish, 100 mm Thermo Scientific 150288
15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane Corning 3477
Watchmaker forceps, no. 5 Dumont 91150-20
Phosphate buffered saline Sigma P4417
Laminin mouse protein Life Technologies 23017-015
Primary antibody, Isl1 Developmental Hybridoma Bank 39.4D5 Dilution 1/100
AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody Life Technologies A11029 Dilution 1/200
Neurobasal medium Life Technologies 21103
B27 supplement (50x)  Life Technologies 17504-044
Leibovitz’s L-15 Life Technologies 21083-027
Penicillin/ streptomycin  Life Technologies 15070
Glucose VWR 101174Y
Heat-inactivated goat serum Sigma G9023
Triton X-100 Sigma T8787
Paraformaldehyde Sigma P6148
Slowfade Antifade Kit Life Technologies S-2828 Alternative mounting solutions may be used
Microscope slides VWR 631-0912
Cover glass VWR 631-0137
Affi-Gel Heparin Beads Biorad 153-6173 Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively
Recombinant human VEGF165 R&D systems 293-VE Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC
Stereo Microscope, Leica MZ16 Leica
Confocal laser scanning microscope  LSM710 Zeiss
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参考文献

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Tillo, M., Schwarz, Q., Ruhrberg, C. Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration. J. Vis. Exp. (85), e51397, doi:10.3791/51397 (2014).
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