إن ربط الف virions بالسطح هو شرط لتصوير الفيروسة الواحدة عن طريق التصوير الفلوري فائق الدقة أو المجهر للقوة الذرية (AFM). هنا نحن نثبت طريقة إعداد عينة للالتصاق الخاضعة للرقابة من virions إلى الأسطح الزجاجية مناسبة للاستخدام في AFM والتصوير الفلوري فائقة الدقة.
تعطيل virions إلى الأسطح الزجاجية هو خطوة حاسمة في التصوير virion واحد. هنا نقدم تقنية اعتمدت من مقايسات التصوير جزيء واحد الذي يسمح التصاق virions واحد إلى الأسطح الزجاجية مع خصوصية. ويستند هذا الإعداد على تطعيم سطح الزجاج مع خليط من PLL-g-PEG وPLL-g-PEG-Biotin، إضافة طبقة من avidin، وأخيرا خلق المراسي virion من خلال مرفق الأجسام المضادة فيروس البيوتينيلات البيوتينية محددة. لقد طبقنا هذه التقنية عبر مجموعة من التجارب بما في ذلك المجهر القوة الذرية (AFM) والتصوير الفلوري فائق الدقة. ينتج عن طريقة إعداد العينة هذه التصاق تحكم للفيروينات إلى السطح.
تستخدم التفاعلات غير المحددة القائمة على الشحن بشكل روتيني لتصاق virions في المجهر للقوة الذرية1،2. هذه التقنيات تعمل بشكل جيد خاصة عند استخدامها على virions غير مجسم مع capsids قاسية جدا3-6. على الرغم من أن هذه التقنيات فعالة جدا في شل العينة، فإنها لا تمنع ربط غير محدد من البروتينات إلى السطح. الربط غير محدد يمكن أن تخلق مشكلة عند محاولة لتصوير virions مع AFM وتقنيات الفلورسينس فائقة الدقة التي تتطلب حضانات العينة مع الأجسام المضادة المختلفة. هنا نوضح طريقة إعداد عينة لشل محددة من virions.
بولي (الإيثيلين غليكول) (PEG) المطعمة إلى بولي (L-lysine) (PLL) ومموج على سطح زجاجي يوفر كتلة كبيرة للتفاعلات الكهروستاتيكية من البروتينات مع الزجاج7. وقد استغلت المقايسات جزيء واحد التي تتطلب شل جزيئات واحدة على الأسطح الزجاجية من هذه الخاصية واستخدامها لإنشاء PEG محددة على أساس تقنية شل جزيء واحد8-10. كما تم استخدام هذا الإعداد لشل أقفاص clathrin على سطح الزجاج11، فضلا عن خلق طلاء فيبروكتين متجانسة للسيطرة على خلية التصاق 12.
لقد اعتمدنا طريقة إعداد العينة على أساس الامتزاز PLL-g-PEG إلى الأسطح الزجاجية من منهجيات تصوير جزيء واحد وتطبيقها على تصوير فيروس واحد من فيروس التهاب الفم الرسغي (VSV). تم تصوير هذه الفيروسات المفردة باستخدام المجهر القوة الذرية (AFM). كما أجريت تجارب مماثلة على الخرز الوظيفي كعنصر تحكم. كما تم تصوير virions بواسطة المجهر الفلوري فائق الدقة كانت الأجسام المضادة VSV-G المسمى مع اليكسا 647 تم استخدامها لخلق صورة للمغلف من virions واحد. يستخدم التصوير الفلوري عالي الدقة توطين جزيئات مفردة لإنشاء صورة13-15. fPALM التصوير ثنائي الخطاف يسمح توطين جزيئات واحدة مع 20 نانومتر في الطائرة و 50 نانومتر القرار على طول المحور البصري15,16. وقد استخدمت هذه التقنية ثنائية الخطاف لتصوير الصور الفلورية فائقة الدقة الموجودة في هذه الدراسة. تقنية بديلة لها نتائج مماثلة هي STORM13,17,18.
كل من AFM وصور الفلورسنت فائقة الدقة من VSV الراسية على الزجاج من خلال الإجراءات المبينة في هذه الورقة، وأظهرت ملزمة محددة من virions إلى الزجاج مع الحد الأدنى من التفاعلات غيرمحددة 19. هنا نقدم بروتوكولات إعداد العينة لAFM وتجارب التصوير الفلوري فائقة الدقة. باختصار: تعمل قطع الأغطية الزجاجية النظيفة عن طريق مبهر خليط من PLL-g-PEG و PLL-g-PEG-biotin. ومن المعتاد لهذا الفيلم رقيقة أن تكون هندسيا لتوفير ما بين 15-25٪ البيوتين وظيفية على سطح مغلفة. يتم احتضان الأغطية بشكل أكبر مع رباعية الميركم أفيدين. ثم يتم استخدام الأجسام المضادة الفيروسية البيوتينية لإنشاء موقع ربط فريد من نوعه للف فحوى. يمكن أن يتم ربط الأجسام المضادة بطريقتين.
الطريقة الأولى هي الأمثل لAFM ومع ذلك فإنه لا يزال مناسبا للتصوير الفلوري فائقة الدقة. في هذه الطريقة يتم التعامل مع سطح أفيدين المغلفة مع الأجسام المضادة البيوتينية قبل التصاق الفيروسي. يتم التعامل مع virions شلت مع اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة لتغطية المغلف والسماح فائقة الدقة التصوير الفلوري من virions.
الطريقة الثانية هي لمهاجمة الفيروس في حل مع الأجسام المضادة البيوتينية واليكسا 647 المسمى الأجسام المضادة قبل التمسك الفيروسات إلى سطح avidin المعالجة. تم تحسين هذه الطريقة لتجارب التصوير الفلوري فائقة الدقة التي يكون فيها استرداد المغلف الفيروسي مهما. هذه الطريقة لديها ميزة السماح طلاء الأجسام المضادة موحدة على السطح الفيروسي. قد يتم خلط الأجسام المضادة البيوتينية مع اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة الفيروسية في النسب التي تسمح لامتزاز كافية من الفيروس إلى السطح المعالج avidin مع الحفاظ على تركيز عال من التسمية الفلورسنت على السطح الخارجي للمغلف الفيروسي. هذه اليكسا 647 وصفت الأجسام المضادة الفيروسية ليست البيوتينية ويمكن شطف الزائدة بعيدا من أجل الحد من الضوضاء الخلفية.
يمكن استخدام التصوير أحادي الفيروسات باستخدام AFM والتصوير الفلوري عالي الدقة كمنهجية بديلة للتصوير المقطعي CryoEM. ولكل منهجية من هذه المنهجيات نقاط قوتها المحددة. على سبيل المثال يمكن القيام به AFM على virions WT مع عدم وجود شرط على وضع علامات على العينة أو البروتينات الفيروسية الداخلية. موقع الهياكل الفيروسية هو deconvolved من مساهماتها في خصائص مرنة من virion.
واحد virion فائقة الدقة التصوير في تركيبة مع النهج الوراثية الفيروسية العكسية وضعت حديثا يصبح تقنية قوية لتوطين انخفاض عدد نسخة البروتينات الفيروسية20. يمكن إجراء الفيروسات المؤتلفة مع استبدال بروتيناتها مع البروتينات المنصهرة في البروتينات الفلورية وتنقيتها باستخدام هذه النهج الوراثية العكسية. على الرغم من أن التصوير فائق الدقة له خصوصية ويرجع ذلك جزئيا إلى وضع العلامات الجينية ، فإنه يتطلب استخدام الفيروسات المتحولة.
AFM والتصوير فائق الدقة هي أساليب مجانية تستخدم استعدادات عينة مشابهة جدا. الأساليب المبينة في هذه الورقة، والتي اعتمدت شكل في وقت سابق من مقايسات التصوير جزيء واحد، تسمح ترسيخ virions واحد مع آثار قليلة على طوبولوجيا virions.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور تيل بوكينغ على بروتوكول إعداد الجزيء الواحد الأصلي. تم دعم هذا العمل من قبل NSF منحة 1121972 (SS).
Glass coverslips (fPALM) | Electron Microscopy Services | 72225-01 | 25 mm Coverslips |
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | SuSoS | – | Stock: 0.5 mg/ml in PBS |
NeutrAvidin biotin-binding protein | Invitrogen | A2666 | Stock: 0.25 mg/ml in PBS |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21245 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
α-VSV-G | Invitrogen | ab34774 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
Gluox | Sigma | G2133-250KU | Glucose oxidase type seven from Aspergillius |
Catalase | Sigma | C40-100mg | Catalase from Bovine liver |
MEA | Sigma | 30070-10G | Cysteamine (MEA |
Stock Buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose | ||
NTE | 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA | ||
Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit | Thermo Scientific | 10,000 MW | |
Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 | Fisherbrand | 35 CIRCLE #1 |