Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol
概要
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
Hepatit C Virüsü (HCV) dünya nüfusunun% 3 etkiler ve kronik hepatit, siroz ve hepatosellüler karsinom gibi ciddi karaciğer rahatsızlıkları olur. HCV, Flaviviridae ailesine ait zarflı bir RNA virüsüdür. Mevcut tedavi, tam etkili değildir ve istenmeyen yan etkilere neden olur. Hiçbir HCV aşısı yoktur. Bu nedenle, devam eden bir çaba bir aşı ve daha iyi bir tedavi geliştirmek için gereklidir. HCV bir hücre kültür sistemi viral girişi, genom replikasyonu, paketleme, ve çıkış da dahil olmak üzere HCV gelişmesinin çeşitli aşamalarında çalışmaları için önemlidir. Sunulan mevcut prosedüründe, bir vahşi tip intragenotype 2a kimerik virüs, FNX-HCV ve virüs çoğaltma incelemek için bir Renilla lusiferaz haberci genini taşıyan bir rekombinant virüs FNX-Rluc kullanılır. Bir insan hepatoma hücre hattı (Huh-7 göre) in vitro transfeksiyonu için kullanılmıştır HCV genomik RNA transkripsiyonu. Hücresiz kültür üst sıvıları, protein lizatlan ve tla m HCV RNA büyümeyi değerlendirmek için post-transfeksiyon işaret çeşitli zaman hasat edilmiştir. HCV genomu, çoğaltma durum nicel RT-PCR ve HCV varlığının görüntülenmesi iki-şeritli RNA tarafından değerlendirildi. HCV protein ekspresyonu HCV NS3 ve NS5A proteinleri için spesifik antikorların kullanıldığı Western blot ve imüno deneyleri ile doğrulanmıştır. Kültür yüzer ve viral titresi olarak bulaşıcı parçacıklar serbest HCV RNA transfekte edilmiş hücreler ölçülmüştür. Lusiferaz deneyleri, raportör HCV'nin replikasyon seviyesi ve enfeksiyon riskini değerlendirmek için kullanılmıştır. Sonuç olarak, HCV replikasyon döngüsünün farklı aşamalarında karakterize etmek için çeşitli virolojik ölçümlerde mevcut.
Introduction
Hepatit C virüsü (HCV), siroz ve karaciğer kanserine neden olur. Bu 350,000 kişi yılda 1-3 ölüyor, dünya çapında 170 milyon kişiyi etkilemektedir. HCV 9.6 kb'lik bir genom boyutuna sahip bir pozitif iplikli bir RNA virüsüdür. HCV genomu, proteolitik olarak 10 polipeptitlere çeşitli hücresel ve viral proteazlar tarafından yarılır ~ 3000 amino asit kalıntıları tek bir poliprotein olarak tercüme edilir. HCV cinsi Hepatit C virüs in prototip virüsüdür ve Flaviviridae familyası 4 aittir. Maruz kalması üzerine, HCV bireylerin% 80, kronik enfeksiyon oluşturur. Enfeksiyon tanısı karaciğer bozulmasını önlemek için terapötik müdahaleye izin verebilir çoğunlukla asemptomatik ve zamanında. Güncel Tedavinin yetersiz olduğunu ve hiç aşı 5,6 mevcuttur.
Hepatit C etyolojisi ilk 1989, 7 'de tarif edilmiştir. HCV replikasyonu incelenmesi hepatit C aşısı ve tedavi araştırmalar için önemlidir, ancak bu olmuştuuzun süre etkili bir viral kültür sisteminin olmaması nedeniyle engellenmektedir. HCV'nin moleküler klon intrahepatik, aşılamadan 8 üzerine şempanzelerde enfeksiyon olduğu gösterilmiştir. Daha sonra, HCV alt-genomik replikonlar, bir hücre kültür sistemi 9,10 viral genom çoğaltma aşamasını incelemek için izin verilmiş olan, tarif edilmiştir. Bir genotip 2a HCV Discovery JFH-1 (Japon fulminan hepatit-1) izole, hücre kültürü enfekte edebilen HCV çoğaltma araştırma 11-13 için yeni yollar açtı. Genotip 2a gerginlik JFH-1 arası ve içi genotipik kimerik virüs ve genotip 1 HCV bazlı bazlı bulaşıcı kültür sistemleri de 14-18 vardır.
Biz başarıyla protein alanları ve sis etkili RNA elemanlarının 19,20 yüksek çözünürlüklü fonksiyonel profil haritasını elde etmek JFH-1 suşu ve HCV intragenotype 2a kimerik virüs kullandık. Buna göre, burada biz olanak rutin kullanılan etkili bir kültür sistemi açıklanmaktadırHCV çoğaltma döngüsü ve konak-patojen etkileşimi çeşitli aşamaları okuyor. Bu viral genomun replikasyonu ve intragenotype 2a HCV ve bir Renilla lusiferaz raportör göre HCV de novo enfeksiyon değerlendirmek virolojik ölçümlerde mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu şekilde, hepatit C virüs çoğaltma döngüsü analiz etmek için bir yöntem tarif eder. HCV insan patojen ve öngörülen biyogüvenlik protokolü kesinlikle takip edilmesi gerekir. Bulaşıcı HCV hücre kültür sistemleri, daha önce 11-13,16,17 tarif edilmiştir. Resimli protokolü takip ederken biz uygulamak birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, alt çalışmalar için olduğu gibi tam uzunlukta viral genomik RNA'nın iyi kalitede olması için büyük önem taşımaktadır. Viral cDNA&#…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
参考文献
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
- Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
- Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
- Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
- Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
- Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
- Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
- Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
- Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
- Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
- Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
- Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
- Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
- Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
- Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
- Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
- Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
- Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
- Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
- Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
- Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
- Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
- Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
- Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
- Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
- Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).
