概要

פרוטוקול לניתוח שכפול נגיף הצהבת מסוג C

Published: June 26, 2014
doi:

概要

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Abstract

וירוס הפטיטיס C (HCV) משפיע על 3% מאוכלוסיית העולם של וגורם למחלות חמורות בכבד כולל צהבת כרונית, שחמת הכבד, וקרצינומה hepatocellular. HCV הוא נגיף RNA אפף השייכת למשפחה Flaviviridae. טיפול הנוכחי אינו יעיל באופן מלא וגורם לתופעות לוואי שליליות. אין חיסון HCV זמין. לפיכך, מאמץ המשיך נדרש לפיתוח חיסון וטיפול טוב יותר. מערכת תרבית תאי HCV היא קריטית ללימוד שלבים שונים של צמיחת HCV כוללים כניסת ויראלי, שכפול הגנום, אריזה, ויציאה. בהליך הנוכחי שהוצג, השתמשנו וירוס 2a intragenotype פראי מסוג chimeric, FNX-HCV, ווירוס רקומביננטי FNX-Rluc נושא גן כתב לוציפראז Renilla ללמוד את שכפול הנגיף. שורת תאי hepatoma אדם (מבוסס הא-7) שימשה עבור transfection של במבחנה עיבד RNAs גנומית HCV. supernatants תא ללא תרבות, lysates חלבון ולאRNA סך נקצרו בזמן שונים מציין שלאחר transfection להעריך צמיחת HCV. מעמד שכפול הגנום HCV הוערך על ידי RT-PCR ופעמים תקועים RNA לדמיין את הנוכחות של HCV. ביטוי חלבון HCV אומת על ידי מבחני כתם וimmunofluorescence מערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבוני HCV NS3 וNS5A. תאי transfected RNA HCV שוחררו חלקיקים זיהומיות לsupernatant התרבות וכייל הנגיף נמדדו. מבחני לוציפראז נוצלו כדי להעריך את רמת השכפול והדבקה של HCV כתב. לסיכום, אנו מציגים מבחני virological שונים לאפיון שלבים שונים של מחזור השכפול של HCV.

Introduction

וירוס הפטיטיס C (HCV) גורם לשחמת כבד וסרטן כבד. זה משפיע 170 מיליון אנשים ברחבי העולם עם 350,000 אנשים מתים מדי שנה 1-3. HCV הוא נגיף RNA גדיל חיובי עם גודל הגנום של 9.6 kb. הגנום HCV מתורגם כמו polyprotein יחיד של ~ 3,000 שאריות חומצת אמינו שהוא ביקע proteolytically ידי פרוטאזות נגיפיות סלולריות שונות ל10 פוליפפטידים. HCV הוא נגיף אב הטיפוס בסוג Hepacivirus ושייך למשפחה של 4 Flaviviridae. עם החשיפה, HCV קובע זיהום כרוני ב80% מהאנשים. הזיהום הוא בעיקר ללא תסמינים בזמן אבחון יכול לאפשר התערבות טיפולית כדי למנוע הידרדרות בכבד. טיפול הנוכחי הוא הכי מוצלח ואין חיסון זמין 5,6.

אטיולוגיה של הפטיטיס C תוארה לראשונה בשינה 1989 7. לימוד שכפול HCV חשוב לחיסון הצהבת מסוג C ומחקר טיפול, אבל זה היההקשו עוד על ידי חוסר של מערכת תרבות ויראלי יעילה. שיבוט מולקולרי של HCV הוצג להיות מידבק שבימפנזים על חיסון intrahepatic 8. בהמשך לכך, replicons HCV תת גנומי תוארו, שאיפשר לנתח את שלב שכפול הגנום הנגיפי ב9,10 מערכת תרבית תאים. גילוי של HCV גנוטיפ 2 א לבודד JFH-1 (הפטיטיס-1 המוחלט של התפקודי היפני), מסוגל להדביק תא תרבות פתח אפיקים חדשים למחקר שכפול HCV 11-13. מתח 2a גנוטיפ JFH-1 וירוסי chimeric בין ותוך genotypic וHCV גנוטיפ 1 מערכות מבוססות תרבות זיהומיות המבוססות זמינות גם כן 14-18.

אנחנו השתמשנו בהצלחה זן JFH-1 ווירוס chimeric 2a intragenotype HCV לך את מפת האפיון פונקציונלי ברזולוציה הגבוהה של תחומים חלבון וcis-מתנהגים אלמנטים RNA 19,20. לפי זה, כאן אנו מתארים מערכת תרבות יעילה בשימוש באופן שיגרתי המאפשרתלומד שלבים שונים של מחזור שכפול HCV והאינטראקציה המאכסן לפתוגן. אנו מציגים מבחני virological להעריך שכפול הגנום נגיפי וinfectivity נובו דה של HCV 2a intragenotype וHCV כתב מבוסס לוציפראז Renilla.

Protocol

מתווה כללית של הפרוטוקול מתואר באיור 1. 1. תאים הכן תקשורת צמיחה מלאה שמכילה 10-15% בסרום שור העובר (FBS), 10 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, 10 HEPES מ"מ, פניצילין (100 יחידות / מיליליטר)…

Representative Results

נגיף הפטיטיס C הוא וירוס RNA. כך למטרה מניפולציה גנטית, cDNA גנומי HCV כבר משובט לתוך וקטור פלסמיד חיידקים. רצף אמרגן RNA פולימראז T7 הוצג מייד לפני סוף '5 של הגנום HCV. מתווה כללית של עבודה ניתוח HCV מוצגת באיור 1. כדי לייצר RNA הגנומי HCV עם הסוף מדויק 3 ', הגנום HCV המכיל פל…

Discussion

איור זה מתאר שיטה לניתוח מחזור השכפול של וירוס הצהבת מסוג C. HCV הוא הפתוגן אנושי ופרוטוקול הבטיחות הביולוגי שנקבע יהיה חייב להיות אחריו בקפדנות. מערכות תרבות זיהומיות HCV תא תוארו בעבר 11-13,16,17. יש כמה נקודות קריטיות שאנחנו ליישם כאשר בעקבות הפרוטוקול המאויר. ראשית,…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Fisher Scientific 10-017-CV
Non essential amino acid Fisher Scientific MT25025CI
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red Life Technologies 11058-021
Huh-7.5.1 The Scripps Research Institute The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)  Cedars-Sinai Medical Center The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaI New England Biolabs Inc. R0145S
Mung Bean Nuclease New England Biolabs Inc. M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System Promega P1320
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm) Bioexpress E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System Bio-Rad 165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
PVDF membrane package Bio-Rad 162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk Bio-Rad 170-6404XTU
Tween-20 Bio-Rad 170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] Abcam ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] Abcam ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)  Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents  GE Healthcare Life Sciences RPN2236
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
ViiA 7 real-time PCR system Life Technologies NA
Renilla Luciferase Assay System kit Promega E2810
RNase-Free DNase Promega M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer) Promega

参考文献

  1. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C. Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).
  2. Alter, M. J. Epidemiology of hepatitis C virus infection. World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).
  3. Lavanchy, D. The global burden of hepatitis C. Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).
  4. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. . Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).
  5. Ciesek, S., Manns, M. P. Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).
  6. Ghany, M. G., et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).
  7. Choo, Q. L., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244 (4902), 359-362 (1989).
  8. Kolykhalov, A. A., et al. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA. Science. 277 (5325), 570-574 (1997).
  9. Lohmann, V., et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science. 285 (5424), 110-113 (1999).
  10. Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).
  11. Lindenbach, B. D., et al. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309 (5734), 623-626 (2005).
  12. Wakita, T., et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).
  13. Zhong, J., et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).
  14. Yi, M., et al. Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus. J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).
  15. Pietschmann, T., et al. Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).
  16. Li, Y., et al. Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).
  17. Yi, M., Lemon, S. Genotype 1a HCV (H77S) infection system. Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).
  18. Gottwein, J. M., et al. Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A. J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).
  19. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathog. 4 (10), (2008).
  20. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  21. Salloum, S., et al. Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets. PLoS Pathog. 9 (8), (2013).
  22. Gonzalez, G., et al. Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA. J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).
  23. Phan, T., et al. Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).
  24. Schaller, T., et al. Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes. J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).
  25. Li, R., et al. Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans. J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).
  26. Jones, C. T., et al. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).
  27. Steinmann, E., et al. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. PLoS Pathog. (7), (2007).

Play Video

記事を引用
Ren, S., Contreras, D., Arumugaswami, V. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (88), e51362, doi:10.3791/51362 (2014).

View Video