Juxtasomal Biocitina Etiquetado para estudiar la estructura-función de la relación de un individuo neuronas corticales
概要
Para entender la estructura de las redes neuronales, la caracterización morfológica y funcional de las neuronas individuales es una necesidad. Aquí, nos demuestran etiquetado juxtasomal biocitina, la cual permite que los registros electrofisiológicos en la configuración extracelular, aún mantiene la capacidad de etiquetar de forma intracelular de la neurona para la reconstrucción post hoc de dendríticas y la arquitectura axonal.
Abstract
La corteza cerebral se caracteriza por múltiples capas y muchos tipos de células diferentes que juntos como una red son responsables de muchas funciones cognitivas superiores, incluyendo la toma de decisiones, el comportamiento sensorial guiada o la memoria. Para entender cómo estas redes neuronales complejas que de tales tareas, un paso crucial es determinar la función (o la actividad eléctrica) de tipos de células individuales dentro de la red, de preferencia cuando el animal está realizando una tarea cognitiva relevante. Además, es igualmente importante para determinar la estructura anatómica de la red y la arquitectura morfológica de las neuronas individuales para permitir la ingeniería inversa de la red cortical. Avances técnicos disponibles en la actualidad permiten el registro de la actividad celular en despierto, comportándose animales con la opción valiosa de post hoc identificar las neuronas registradas. Aquí, nos demuestran la técnica de etiquetado biocitina juxtasomal, que implica la acción de grabación de potenciómetroal clavar en la configuración extracelular (o floja-patch) utilizando pipetas de parche convencionales. La configuración de la grabación juxtasomal es relativamente estable y aplicable a través de condiciones de comportamiento, incluyendo anestesiado, sedado, despierto cabeza fija, e incluso en el animal se mueve libremente. Por lo tanto, este método permite la vinculación de tipo celular específico acción potencial durante Rematar comportamiento de los animales a la reconstrucción de las neuronas individuales y en última instancia, la totalidad de microcircuito cortical. En este manuscrito de vídeo, se muestra cómo las neuronas individuales en la configuración juxtasomal se pueden marcar con biocitina en ratas anestesiadas con uretano para la identificación post hoc y la reconstrucción morfológica.
Introduction
Redes neuronales consisten en múltiples tipos de células, que se caracterizan por propiedades morfológicas y fisiológicas altamente específicos 1-7. Como consecuencia de ello, los tipos de células individuales realizan tareas especializadas dentro de la red (véase, por ejemplo Gentet et al. 8 y Burgalossi et al. 9). Sólo estamos empezando a entender las funciones específicas del tipo de células a través de redes neuronales y queda aún mucho por descubrir. Para este fin, muchos laboratorios están aplicando enfoques experimentales que permiten el análisis de las propiedades morfológicas de la misma población neuronal de la que se han obtenido parámetros fisiológicos 1,10-15. Aquí, se demuestra la técnica de etiquetado juxtasomal 16,17 que implica registros electrofisiológicos usando pipetas de parche convencionales en la configuración extracelular (de este modo no invasivo) en combinación con la electroporación de la neurona registrada con biocitina. Laimportante ventaja de este enfoque es que la naturaleza no invasiva asegura que el potencial de acción Rematar de las neuronas individuales se registra sin alterar (por ejemplo, diálisis) el contenido intracelular de la célula. Seguido por electroporación, el enfoque juxtasomal proporciona la opción de identificación post hoc celular y la reconstrucción de enlace de función (fisiología) a la estructura (morfología). Típicamente, la reconstrucción morfológica consiste en la reconstrucción de la morfología dendrítica y axonal que se puede extender a la cuantificación de la columna vertebral y / o Bouton densidades o incluso la reconstrucción de la morfología neuronal en resolución nanométrica utilizando microscopía electrónica. La técnica de grabación juxtasomal se puede utilizar para las grabaciones en vivo de varios tipos de células a través de las capas corticales o en áreas subcorticales en una gama de especies, aunque la mayoría de los estudios han aplicado la técnica en pequeños roedores tales como ratones o ratas. Nuestra investigación se centra en el registro y etiquetado de las neuronasde rata corteza somatosensorial primaria (S1) e implica la identificación visual de las neuronas registradas 18, reconstrucciones dendríticas en combinación con un registro preciso en un marco de referencia estandarizada para ingeniería inversa redes corticales 4,19 y reconstrucción detallada de la arquitectura axonal caracterizar específica del tipo celular local y proyección a largo plazo dirigido a 20.
En comparación con las técnicas de grabación en vivo alternativas (intracelulares o de células enteras), grabaciones juxtasomal son relativamente estables y por lo tanto pueden aplicarse a distintos estados de comportamiento incluyendo anestesiado 21,22, sedados 14, Pista de los animales-fijo 23, o incluso se mueven libremente despiertos 9 . Aquí, mostramos etiquetado juxtasomal en S1 de una rata anestesiada con uretano, aunque hacemos hincapié en la aplicabilidad general de esta técnica para muchas preparaciones de elección.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método juxtasomal permite la grabación en vivo de acción potencial enriquecidas a partir de unidades individuales a través de las condiciones de comportamiento (anestesiados, despierto cabeza fija o moviéndose libremente) con la opción de biocitina-etiquetar la neurona registrada en post hoc clasificación de tipos de células y / o reconstrucción 3D. La principal ventaja es obtener parámetros fisiológicos en la configuración extracelular (de este modo no invasivo), sin embargo, ser capaz …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a los Profs. Huibert Mansvelder y Bert Sakmann de amplio apoyo, el Dr. Marcel Oberlaender para un debate fructífero y proporcionar rastreo neuronal, y Brendan Lodder para la asistencia técnica. Los datos fueron adquiridos utilizando el ntrode VI para LabVIEW, generosamente proporcionado por R. Bruno (Columbia Univ., NY, EE.UU.). Esta investigación fue apoyada por la Sociedad Max Planck y el Centro Bernstein para la Neurociencia Computacional, Tubinga (financiado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Centro de Investigación Cognitiva y Neurogenomics (CNCR) , Campus de Neurociencias Amsterdam (NCA), la financiación de CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 y ENC-red # p3-c3) y la Universidad VU de Amsterdam.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
参考文献
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O’Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
