Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

ÉTICA DECLARAÇÃO Amostras humanas e animais foram processados ​​de acordo com as diretrizes do Ministério da Saúde italiano, a lei 116/92 e da Directiva 86/609/CEE do Conselho Comunidades Europeias. 1. As culturas de células monócitos Culturas humanos THP-1 em células T-75 frascos contendo meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro humano, 50 U / ml de penicilina e 50 mg / ml de estreptomicina, 0,05 mM β-mercaptoetanol a 37 ° C em 5% de CO 2. Culturas Dividir quando confluentes (a cada 3-5 dias). 2. Isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir de Buffy Coats Antes de iniciar o protocolo de isolamento, preparar uma solução de tampão fosfato salino (PBS) pH 7,2, 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,5% de albumina sérica bovina (BSA), a adição de 5 ml de BSA da solução para 95 ml de tampão de enxaguamento (1: 20 diluição). Degas o buffer e mantê-lo frio (2-8° C). IMPORTANTE: A não degas a reserva pode resultar em menos do que ideal resultados porque as bolhas podem bloquear a coluna isolamento (veja o passo 3.2). Nota: Anticoagulante citrato dextrose fórmula-A (ACD-A) ou citrato fosfato dextrose (CPD) pode ser usado em alternativa. Por outro lado, outras proteínas de albumina ou de soros provenientes de outras espécies pode substituir BSA. Não use tampões contendo Ca 2 + ou Mg 2 +. Obter capa flogística de doadores saudáveis ​​(com idades entre 20-60 anos de idade). Prepare 50 ml tubos cônicos de gradiente de densidade centrifugação. Determinar o número de tubos necessários para o processamento de sangue (cada tubo pode processar 35 ml de sangue diluído) e adicionar 15 ml de Ficoll-Paque em cada tubo vazio. Dilui-se 8 ml de sangue com 24 ml de / BSA a solução de EDTA PBS / (1:4 diluição). Camada cuidadosamente a solução diluída no topo do Ficoll-Paque (densidade = 1,077 g / ml) em cada um dos tubos de 50 mL cónicos. Não mistureo sangue e de Ficoll-Paque. IMPORTANTE: Para evitar a mistura do sangue e Ficoll-Paque, mantenha o tubo em um ângulo de 45 ° e camada da mistura de sangue lentamente. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a 4 ° C. As células mononucleares (MNCs) permanecerá na interface plasma-Ficoll-Paque, enquanto granulócitos e eritrócitos de sedimentos devido à maior densidade na pressão osmótica de Ficoll-Paque. Transferir as células de interfase (células mononucleares do sangue periférico, PBMCs) para um novo tubo de 50 ml cheio com PBS / BSA / EDTA e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Lava-se a pelete duas vezes com PBS / BSA / EDTA para remover as plaquetas. Girar a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. Cultura as células em completo RPMI-1640 com 10% de soro humano e antibióticos ou prosseguir para monócitos purificação. 3. Purificação de monócitos a partir de PBMC primária Isolar monócitos de PBMC por esférulas magnéticas separação usando Hum.um kit de isolamento de monócitos Pan: Passar as células através de uma malha de nylon de 30 um (filtros de pré-separação de 30 mm), para remover eventuais grumos celulares. Determinar o número de células usando um hemocitômetro. Suspensão de células de centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente (RT). Aspirar o sobrenadante completamente. Ressuspender o sedimento celular em 30 ul de tampão de PBS / EDTA / BSA por cada 10 7 células totais. Adicionar 10 ul de reagente de bloqueio FcR por 10 7 células totais. Adicionar 10 ml de Cocktail Biotina-Anticorpo por 10 7 células totais. Misturar bem e incubar durante 5 min a 2-8 ° C. Adicionar 30 mL de tampão por 10 7 células totais. Adicionar 20 ul de microesferas anti-biotina por 10 7 células totais. Misturar bem e incubar durante 10 min a 2-8 ° C. Ressuspender 8 até 10 células em 500 ul de tampão de PBS / EDTA / BSA. Separ magnéticoção Assim que o número total de células, escolha uma coluna de MACS apropriado e MACS Separador (ver MACS Coluna folha de dados). Colocar a coluna no campo magnético do separador MACS. Prepare a coluna por lavagem com a quantidade apropriada de tampão de PBS / EDTA / BSA (colunas MS: 500 ul; colunas LS: 3 ml). Nota: As colunas são "parada fluxo" e não secam. Aplicar a suspensão de células para dentro da coluna. Colete de fluxo contendo células não marcadas, o que representa a fração de monócitos enriquecido. Lave coluna 3x com tampão PBS / EDTA / BSA (500 mL de MS e 3 ml para LS por lavagem). Coletar as células não marcadas que passam, representando as células monócitos enriquecidos, e adicione ao fluxo através da seção 3.2.4. Nota: Lava-se a coluna por adição de alíquotas de tampão de PBS / EDTA / BSA apenas quando o reservatório está vazio da coluna. (Opcional) Retirar a coluna doseparador e coloque-o em um tubo de coleta adequado. Pipetar o tampão na coluna (colunas MS: 1 ml; colunas LS: 5 ml). Lave imediatamente as células nonmonocyte magneticamente rotulados com firmeza empurrando o êmbolo para a coluna. Cultura de monócitos em meio RPMI-1640 completo purificado com 10% de soro humano e antibióticos. 4. A purificação do primário a partir de monócitos de sangue inteiro Purifica-se monócitos a partir de sangue total usando o kit de isolamento de monócitos de sangue inteiro, seguindo as instruções do fabricante. 5. Nanopartículas Internalização no sangue leucócitos e monócitos purificados Placa de 5 x 10 5 células / ml (1 ml / cavidade) das PBMC isoladas ou purificadas os monócitos CD14 positivos em uma placa de 12 poços. Vortex FITC-SiO 2 nanopartículas solução estoque e ressuspender em meio completo a uma concentração de trabalho de 100 nM. Adicionar 10 ul de nanop de trabalhosuspensão de artigo (100 nM) nas amostras tratadas para atingir uma concentração final de nanopartículas de 1 nM. Adicionar o mesmo volume de meio completo de controlos não tratados para cada poço. Depois de 1 hr a internalização recolher as amostras em tubos de polipropileno de 1,5 ml e centrifugar para durante 3 minutos a 6000 xg à temperatura ambiente. Lava-se a pelete com 1 ml de tampão de corrida 3 min a 6000 xg à temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento em 200 ul de tampão de corrida. As células são agora pronto para a leitura, por citometria de fluxo. 6. Isolamento de culturas mista glial primárias (Veja Bertero et al. 7) 7. Repique uma cultura de células gliais Confluent Mista Lavar um frasco T-75, uma vez com 10 ml de PBS (w / o Ca 2 + / Mg 2 +), em seguida, adicionam-se 10 mL de Versene e incubar a 37 ° C durante 5-7 min. Pipeta-se o sobrenadante para cima e para baixo várias vezes, de modo a separar as células da superfície do T-75 e dissolveragregados celulares. Transferência da suspensão de células em tubos de polipropileno de 15 ml. Recolha uma pequena quantidade de suspensão celular para contagem das células com um hemocitómetro. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em uma concentração final de 5 x 10 5 células / ml em meio de cultura completo glial. Placa de 0,5 ml / poço numa placa de 24 poços e deixar que as células se contentar com 2-4 horas antes do tratamento de nanopartículas. 8. Nanopartículas Internalização em Microglia Adicionar 500 ul de meio de cultura completo glial (para os controlos não tratados) ou 500 ul de uma suspensão 2x Rodamina-SiO2 nanopartículas em meio de cultura completo glial (para amostras tratadas) para cada poço. Pipetar as células para permitir o destacamento das células nonrapid-aderente em pontos de tempo seleccionados e recolher em tubos de polipropileno de 2 ml. Adicionar 500 mLde Versene a cada poço e incubar a placa a 37 ° C durante 5 min, em seguida, separar a fracção celular remanescente e recolher cada amostra com as correspondentes células nonadhering da etapa anterior. Centrifugar as amostras durante 3 minutos a 300 xg à temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão de corrida AutoMACS. 9. A coloração com CD11b-VioBlue Adicionar 10 ul de VioBlue-CD11b anticorpo humano / ratinho 100 ul de suspensão de células (razão 1:11) em tampão de corrida e incubar 10 min a 4 ° C. Adicionar 1 ml de tampão de corrida e misturar a suspensão de células. Centrifugar cada amostra durante 3 minutos a 300 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100-150 mL de tampão de corrida. Ler as amostras para o citómetro (armazenar as amostras a 4 ° C entre os dois últimos passos). IMPORTANTE: antes de analisar as amostras, proceder à compensação da sobreposição de sinais iOs espectros de emissão n observada entre diferentes fluorocromos (nanopartículas ou anticorpos fluorocromo-conjugados). 10. Derramamento espectral sobre Compensação Abra a caixa de "Configurações do instrumento" (presente em todos os programas de software de instrumento). Nota: Se estiver usando um instrumento diferente do relatado na tabela de materiais, por favor consulte o manual específico instrumento para os detalhes da aquisição. Adquirir amostra não tratada (sem nanopartículas) em baixa velocidade fluídico (se permitido pelo instrumento). Durante a aquisição, ajustar manualmente para a frente eo lado de dispersão (FSC e SSC, respectivamente), regulando os canais de tensão. Nota: Modificar as escalas dos eixos SSC e FSC, a fim de melhor visualizar a população de células completo na trama. Um instrumento definir modelo para cada tipo de célula de interesse pode ser criado, salvo e usado para futuras aquisições. Abra o específicoSeparador "região" no software. Desenhe uma região grande apropriada ("gate") em torno da população desejada. Nota: Internalização de nanopartículas induz uma mudança SSC das células. Se a porta é muito estreita restrito em torno da população de células de interesse, os dados adquiridos provavelmente vai perder parte das células a serem detectados. Use duas amostras não coradas, um para uso como amostra em branco e uma de indemnização contra coloração PI (opcional), um single-coradas amostra com o fluorocromo apropriado para cada canal de fluorescência para ser compensado. Nota: Utilizar um tubo de 1,5 ml de amostra diferente para cada um dos anticorpos conjugados com fluorocromos para ser utilizada na rotulagem experimento. Abra a aba "Compensação" na caixa "Configurações do Instrumento". Aumentar ou diminuir o fator de compensação durante a aquisição até a intensidade de fluorescência no canal spillover é mais ou menos o mesmo para o pos fluorocromotivo e da população negativa. Adquirir amostras tratadas com nanopartículas após a compensação foi ajustado.