유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

윤리 선언문 인간과 동물의 샘플이 건강의 이탈리아 교육부의 지침에 따라 처리 된 법 92분의 116 및 유럽 공동체위원회 지침 86/609/EEC. 1. 단핵구 세포 배양 10 % 인간 혈청, 50 U / ㎖ 페니실린 및 50 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 5 % CO 2에서 37 ° C에서 0.05 MM의 β-머 캅토 에탄올로 보충 RPMI-1640 배지가 포함 된 T-75 플라스크 문화 인간 THP-1 세포. 분리 배양 할 때 합류 (매 3-5 일). 2. 버피 코트에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 분리 분리 프로토콜을 시작하기 전에 인산 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.2의 용액을 준비하고, 2 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 버퍼 (세척 1 95 ml로 5 ㎖ BSA 스톡 용액을 첨가 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), : (20) 희석). 버퍼 가스를 제거하고 2-8 (차가운 곳에 보관° C). 중요 : 거품이 분리 컬럼 (단계 3.2 참조)를 차단할 수 있기 때문에 버퍼가 최적이보다 결과가 발생할 수 있습니다 가스를 제거하지 못하면. 참고 : 항응고제 시트르산 덱 스트로스 식-A (ACD-A) 또는 시트 레이트 포스페이트 덱 스트로스 (CPD)가 대안 적으로 사용될 수있다. 반대로, 다른 종의 다른 알부민 단백질이나 혈청 BSA를 대체 할 수있다. 칼슘 + 마그네슘 또는 2 +를 포함하는 버퍼를 사용하지 마십시오. (20~60년 이전 세) 건강한 기증자 버피 코트를 얻습니다. 밀도 기울기 원심 분리 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 혈액을 처리 (각 관 희석 혈액의 35 ML을 처리 할 수​​ 있습니다) 각각의 빈 튜브에 피콜-Paque 15 ㎖를 추가 할 필요 튜브의 수를 결정합니다. PBS / BSA / EDTA 용액 (1:4 희석) 24 ㎖의 혈액 8 ㎖를 희석. 조심스럽게 (밀도 = 1.077 g / ㎖) 50 ML 원뿔 튜브의 각 피콜-Paque 위에 희석 된 솔루션을 계층. 혼합하지 마십시오혈액과 피콜-Paque. 중요 : 혈액과 피콜-Paque의 혼합을 방지하기 위해 45 ° 각도로 튜브를 잡고 천천히 혈액 혼합물 층. 4 ℃에서 30 분 400 XG에 원심 분리기 단핵 세포 (다국적 기업) 과립구 및 적혈구 침전물 반면 인해 피콜-Paque의 삼투압에 높은 밀도, 플라즈마 피콜-Paque 인터페이스에 남아있을 것입니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 PBS / BSA / EDTA와 원심 분리기로 가득 찬 새로운 50 ㎖ 튜브에 계면 세포 (말초 혈액 단핵 세포, PBMC를)을 전송 혈소판을 제거하는 PBS / BSA / EDTA로 두 번 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 10 분 동안 200 XG에 스핀 10 % 인간 혈청과 항생제 또는 단핵 세포 정화를 진행 완료 RPMI-1640 문화가 세포. 3. PBMC를 차에서 단핵구의 정화 험을 사용하여 자기 비드 분리가 된 PBMC에서 단핵 세포를 분리팬 단핵구 분리 키트 : 가능한 세포 덩어리를 제거하기 위해 30 μm의 나일론 메쉬 (preseparation 필터, 30 μM)을 통해 세포를 전달합니다. 혈구를 사용하여 세포 수를 결정합니다. 실온 (RT)에서 10 분 300 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. 대기음이 완전히 뜨는. 10 7 전체 세포 당 PBS / EDTA / BSA 버퍼 30 μL의를 Resuspend 세포 펠렛. 10 7 전체 세포 당 차단 시약 10 μL의 FcR를 추가합니다. 10 7 전체 세포 당 비오틴 항체 칵테일의 10 μl를 추가합니다. 잘 혼합하고 2-8 ℃에서 5 분 동안 품어 10 7 전체 세포 당 버퍼의 30 μl를 추가합니다. 10 7 전체 세포 당 안티 – 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다. 잘 혼합하고 2-8 ℃에서 10 분 동안 배양 PBS / EDTA / BSA 버퍼 500 μL에 10 8 셀을 재현 탁. 자기 저전압 회로 차단기ATION 이에 따라 총 세포 수에 적절한 MACS의 기둥 및 MACS 분리기 (MACS 열 시트를 참조하십시오)를 선택합니다. MACS 분리기의 자기장에 열을 놓습니다. PBS / EDTA / BSA 버퍼의 적절한 양의 세척에 의해 열을 준비 (MS 열 : 500 μL, LS 열 : 3 ㎖). 참고 : 열은 "흐름 정지"하고 건조 실행되지 않습니다. 칼럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 풍부한 단핵구 분율을 나타내는 레이블이없는 세포를 포함하는 흐름을 통해 수집합니다. PBS / EDTA / BSA 버퍼 (MS 500 μL 및 세척 당 LS 3 ml)로 열 배를 씻으십시오. 풍부한 단핵구 세포를 대표하는, 통과 레이블이없는 세포를 수집하고, 3.2.4 절에서 흐름을 통해 추가 할 수 있습니다. 참고 : 열 저수지가 비어있는 경우에만 PBS / EDTA / BSA 버퍼 분주을 추가하여 열을 씻으십시오. (선택 사항)에서 열을 제거구분과 적절한 포집 관에 놓습니다. 칼럼에 버퍼를 피펫 (1 ㎖를, LS 열 : MS 열 5 ㎖). 즉시 단단히 열에 플런저를 밀어 자기 표시 nonmonocyte 세포를 세척하십시오. 문화는 10 % 인간 혈청과 항생제로 완전한 RPMI-1640 단핵 세포를 정제. 4. 전체 혈액에서 단핵구 차의 정화 제조업체의 지침에 따라 전체 혈액 단핵 세포 분리 키트를 사용하여 전혈에서 단핵 세포를 정화. 5. 혈액 백혈구 및 정제 된 단핵 세포에 나노 입자의 국제화 12 – 웰 플레이트에 고립 된 PBMC 또는 정제 된 CD14 양성 단핵 세포 접시 5 × 10 5 세포 / ㎖ (1 ㎖ / 웰). 100 nm의 작업 농도에 완전 배지에서 소용돌이 FITC-그런가 2 나노 입자 원액과에 resuspend. 작업 nanop의 10 μl를 추가합니다1 nm의 나노 입자의 최종 농도에 도달하는 처리 샘플 문서 서스펜션 (100 NM). 각 웰에 처리되지 않은 컨트롤에 대한 완전한 매체의 동일한 볼륨을 추가합니다. 1 시간의 내면화는 1.5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 샘플을 수집하고 RT에서 6,000 XG에서 3 분을 원심 분리 한 후. RT에서 6,000 XG에서 버퍼 3 분의 실행 1 ㎖로 펠렛을 씻으십시오. 버퍼를 실행 200 μL에 펠렛을 Resuspend. 세포는 이제 유동 세포 계측법에 의해 읽기위한 준비가되어 있습니다. 6. 주 혼합 된 아교 문화의 절연 (Bertero보기 등. 7) 7. 혼합 된 아교 플루 세포 배양을 Replating 다음 센과 10 ㎖를 추가하고 5-7 분 동안 37 ° C에서 알을 품다, (W / CA 2 + / 마그네슘 2 + O) PBS 10 ㎖로 한 번 T-75 플라스크를 씻으십시오. T-75의 표면에서 세포를 분리하고 해산하기 위해 위아래로 여러 번 뜨는을 피펫세포 집합체. 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 혈구와 세포를 세는 세포 현탁액의 소량을 모은다. RT에서 300 XG에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. 상등액을 제거하고 신경교 완전 배지에서 5 × 105 세포 / ml의 최종 농도로 펠렛을 재현 탁. 24 웰 플레이트에 0.5 ㎖ / 잘 플레이트 및 세포 나노 입자 치료 전 2-4 시간 동안 정착하자. 8. 소교 세포에 나노 입자 국제화 각 웰 (치료 컨트롤에 대한) 완전한 아교 세포 배양 배지 500 μL 또는 (처리 샘플에 대한) 완전한 아교 배지에서 2 배 로다 민 – 그런가 2 나노 입자 현탁액 500 μl를 추가합니다. 선택한 시점에서 nonrapid 고착 세포의 분리를 허용하고 2 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브를 수집하는 세포를 피펫. 500 μl를 추가합니다센과의 각 웰에 5 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어 다음 나머지 세포 분획을 분리하고 이전 단계의 해당 nonadhering 세포를 각각의 샘플을 수집합니다. RT에서 300 XG에서 3 분 동안 원심 분리. 버퍼를 실행 AutoMACS 100 μL에 펠렛을 Resuspend. 9. 는 CD11b-VioBlue로 염색 버퍼를 실행에 세포 현탁액 (1시 11분 비율) 100 μL에 VioBlue-CD11b를 인간 / 마우스 항체의 10 μl를 추가하고 4 ℃에서 10 분 알을 품다 버퍼를 실행의 1 ML을 추가하고 세포 현탁액을 섞는다. 300 X g에서 3 분 동안 원심 분리기 각 샘플. 뜨는을 취소하고 버퍼를 실행하는 100 ~ 150 μL에 펠렛을 재현 탁. 사이토에 샘플을보기 (마지막 두 단계 사이에 4 ° C에서 샘플을 저장). 중요 : 샘플을 분석하기 전에, 중복 신호의 보상을 진행 난N 방출 스펙트럼은 서로 다른 형광 색소 (fluorochrome가 공역 나노 입자 또는 항체) 사이에서 관찰. 10. 보상 이상의 스펙트럼 유출 "기기 설정"상자 (모든 기기의 소프트웨어 프로그램에 존재)를 엽니 다. 주 : 자료 표에보고 된 것과 다른 악기를 사용하는 경우, 수집 정보의 악기 별 설명서를 참조하십시오. 낮은 유체 속도 (기기에 의해 허용 된 경우)에서 (나노 입자없이) 처리되지 않은 샘플을 획득. 획득 동안, 수동으로 채널 전압을 조절함으로써 조절 전방 및 측면 산란 (각각 FSC와 SSC,). 참고 : 최상의 음모에 전체 세포 인구를 시각화하기 위해 SSC와 FSC 축 스케일을 수정합니다. 그 각각의 세포 유형에 대한 템플릿을 설정하는 계기가 만들어 저장하고 미래의 인수를 사용할 수 있습니다. 특정를 엽니 다소프트웨어의 "지역"탭을 선택합니다. 원하는 인구의 주위에 적절한 큰 지역 ( "문")을 그립니다. 참고 : 나노 입자의 국제화가 세포의 SSC 변화를 유도한다. 게이트가 너무 밀접 그 세포 집단의 주위에 제한되는 경우에, 취득 된 데이터가 아마도 검출 될 셀 부분을 놓칠 것이다. 두 흠 샘플, 빈 샘플로 사용하기 위해 하나 PI 염색 (선택 사양)에 대한 보상을위한 하나, 보상 될 각 형광 채널에 적합한 형광 색소와 하나의 스테인드 샘플을 사용합니다. 참고 : 실험 라벨에 사용되는 각 형광 색소 – 공액 항체 다른 1.5ml의 샘플 튜브를 사용한다. "기기 설정"상자에서 "보상 탭"을 엽니 다. 증가 또는 유출 채널에서 형광 강도는 형광 색소 POS 대해 대략 동일 할 때까지 수집하는 동안 보상 계수를 감소을 직관적이고 부정적인 인구. 보상이 조정 된 후 나노 입자 처리 된 샘플을 획득.