Выделение и количественная оценка ботулинического нейротоксина Из комплексных матриц с использованием BoTest Matrix Анализы

Нейротоксинов ботулина (BoNTs) являются самыми смертоносными вещества, известные, с внутривенных человека смертельных доз оценивается в 1-3 нг / кг ^1,2. Семь структурно подобные серотипов BoNT, помечены через G, существует, каждый из которых состоит из тяжелой цепи домена, ответственного за связывание клеток, поглощение, и транслокации в цитозоль и легкой цепи, которая кодирует цинка эндопептидазы ^3-5. Изысканный токсичность BoNT результатом, в частности, его специфического связывания и вступление в моторных нейронов в нервно-мышечном соединении ^6. Оказавшись внутри нейрона, легкой цепи эндопептидаза специально расщепляет один или несколько из растворимого N-этилмалеимид чувствительных рецепторов белка привязанность фактором (SNARE) белков, необходимых для слияния пузырьков, ингибирования высвобождение нейромедиаторов и приводит к вялым параличом ^7-14. Обычно известный как болезнь "ботулизма", паралич диафрагмы и межреберных мышц по BoNT в конечном итоге приводитдыхательная недостаточность и смерть, если ранней диагностики и лечения принимаются.

Человека пищевого ботулизма чаще всего ассоциируется с ботулинического токсина серотипов A, B, E, и F (BoNT / A, BoNT / B, и т.д.) и обычно возникает в результате употребления в пищу загрязненных продуктов питания ^15,16, хотя несколько случаев раны ботулизма было зарегистрировано среди потребителей инъекционных наркотиков ^17,18. В Соединенных Штатах, детский ботулизм в результате проглатывания Clostridium спор детьми в возрасте до одного является наиболее распространенной формой ботулизма ^19-21. Тем не менее, были зарегистрированы пищевые вспышки ботулинического токсина в результате неправильного домашнего консервирования и переработки пищевых продуктов как в Соединенных Штатах и ​​за рубежом. Между 2000-2009 было зарегистрировано по меньшей мере 338 случаев пищевого ботулизма во всем мире в том числе шесть погибших ^22. Способность быстро и чутко обнаружить пищевого происхождения вспышек ботулизма является одним из важнейших признаков того, что может помочь ранней диагностики ^23,24. Кроме того, методы обнаружения, которые позволяют экономически эффективным и рутинное тестирование питания приведет к улучшению продовольственной безопасности.

Нейронов специфика Бонт и долго биологического полураспада также делает его мощным терапевтическим. В Соединенных Штатах, наркотики ботулинического токсина типа на основе утверждаются по контролю за продуктами и лекарствами для лечения косметических состояний и нервно-мышечных расстройств, связанных в том числе глабеллярных линий, цервикальной дистонии, мигрени, гиперактивного мочевого пузыря, и косоглазия. Многочисленные "не по прямому назначению" приложений задокументированы, в том числе высоких доз лечения тяжелой дисфункцией мышц ^25-28. Точная токсин количественное имеет решающее значение для правильного дозирования, как недокомпенсация может привести к неэффективному лечению в то время как передозировка ставит пациентов риску потенциально вредных побочных эффектов. К сожалению, ни стандартизированный протокол потенции анализ не является общим для производителей, в результате чего неравенства четкости блок между ботулинического токсина типа на основе произво наркотиковк.т.н. ^29-31.

Стандартный тест на BoNT является биоанализа мыши, в котором BoNT-содержащие образцы инъецировали внутрибрюшинно мышам и количество смертей, зарегистрированных в течение 1-7 дней ^16,32,33. Биологический мыши очень чувствительна с пределов обнаружения (LOD) 5-10 пг BoNT / A ^34, однако этические опасения по поводу использования животных, высокая стоимость обучения персонала и поддержание объектов животного, длинные раз анализе и отсутствие стандартизированные протоколы привели призывы разработать стандартизированную, животное без Бонт тестирования и методы количественной ^35-39. В последнее время несколько альтернативные методы ботулинического токсина количественного были разработаны, которые предлагают мыши или почти мыши чувствительность биопроб ^40-49. Эти методы обычно используют флуоресценцию, масс-спектрометрии, или иммунологические методы и предлагают раз опробования значительно короче биопроб мыши без использования животных. Масс-спектрометрии подходов в сочетании с иммунологической TechniqЕЭС были показаны для выявления и количественной BoNT содержится в продуктах питания и других сложных образцов, однако требования к обучению персонала и предел специализированное оборудование этих анализов ^50-55. Большинство других альтернативных анализы не всегда применимы к сложной образца тестирования или не хватает пропускной способности, необходимой для регулярного тестирования ботулинического токсина. Сильно варьирует характер образца пищевой вязкости, рН, содержание солей и матричных компонентов представляет особенно трудную задачу, пытаясь развить в пробирке методы анализа с чувствительностью, чтобы соответствовать крайнюю потенцию BoNT. Кроме того, даже простые и относительно доброкачественные буферные системы, такие, как в результате ресуспендированием лекарственных продуктов ботулинического токсина типа на основе, содержат соли, альбумина и сахара стабилизаторы (т.е. наполнители), что значительно повлиять в пробирке BoNT потенции ^56. Очистка Токсин требуется для точной деятельности тестирования всех, кроме простейших образцов ^56-59.

BoTest Матричные анализы предназначен для быстрого, высокой пропускной способностью, и в соответствии количественное BoNT от очень сложных образцов с использованием оборудования обычно встречаются в научно-исследовательских лабораториях ^56,60. Эти анализы использовать парамагнитные шарики, ковалентно связанные с серотипа конкретных анти-ботулинического токсина антител связываться и поглощения Бонт из образца, а затем удалить вмешиваясь матричные соединения промывкой. После промывания, граница протеолитическую активность ботулинического токсина затем количественно в оптимизированном реакционного буфера, используя репортер, совместимый с серотип ботулинического токсина проходит испытания. Эти репортеры флуорогенные белки, состоящие из N-концевой голубой флуоресцентный белок (СФП) фрагмент и желтый флуоресцентный производной (Венера) фрагмент С-концевой белок, связанный с помощью ботулинического токсина подложки, SNAP25 остатков 141-206 или синаптобревин остатков 33-94 составляющих BoTest / E или B / D / F / G репортеры, соответственно ^45. Репортер расщепление BoNT контролируется с использованием Förster резонансный перенос энергии (FRET). При тон репортер не повреждена, возбуждение CFP приводит лад с Венеры, закалки эмиссию CFP и интересно излучение Венеры. Расщепление репортера по BoNT предотвращает FRET, что приводит к увеличению эмиссии CFP и снижения выброса Венера. BoNT активность может быть количественно измерена с помощью соотношение количества выбросов CFP и Венеры. LOD ниже 3 мкг возможны из широкого спектра пищевых продуктов с использованием высокой пропускной формат 96-луночный планшет ^56. Увеличение чувствительности могут быть получены с использованием больших объемов образцов, так как анализ позволяет концентрацию токсина на поверхности шарика.

Матрица анализы BoTest для BoNTs А, В, Е и F были разработаны и протестированы с пищевой, фармацевтической, и проб окружающей среды ^56,60. Здесь мы описываем процедуры для выполнения этих анализов для обнаружения BoNT в низкой сложности (например, фармацевтической, BoNT в буфере) и высокая сложность (например, продукты питания, экологической) образцы. Конкретные методы обработкина несколько типов образцов, рассматриваются в данном протоколе и типов образцов, не описанные здесь, как правило, могут быть адаптированы с помощью комбинации представленных методов. Протокол был разработан и испытан с BoNT / A, но адаптированы к условиям других серотипов ботулинического токсина использовали свою анализов, как показано в другом месте ^56,60.