BoTestマトリックスアッセイを使用して複雑なマトリックスからの単離およびボツリヌス神経毒素の定量化

ボツリヌス神経毒素（BoNTを）が知られている最も致命的な物質で、1〜3 NGと推定静脈人間の致死量に/ ^1,2キロ。七つのBoNT血清型は構造的に類似し、Gを介して標識され、各々は、サイトゾルと亜鉛エンドペプチダーゼ^3-5をコードする軽鎖への細胞結合、取り込み、および転座に関与する重鎖ドメインからなる、存在する。部分的には、その具体的な結合および神経筋接合部⁶での運動ニューロンへのエントリーからのBoNT結果の絶妙な毒性。一旦ニューロンの内部に、軽鎖エンドペプチダーゼを特異的に切断する可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質レセプター（SNARE）小胞融合に必要なタンパク質の1つ以上が、神経伝達物質放出を阻害し、弛緩性麻痺^7-14をもたらす。一般的疾患」ボツリヌス中毒」のBoNTによる横隔膜や肋間筋の麻痺として知られ、最終的には、その結果早期診断と治療しない限り、呼吸不全や死を受けている。

人間の食品媒介性ボツリヌス症は、最も一般的なBoNT血清型A、B、Eに関連付けられており、通常は、F（BoNT / A型、のBoNT / B 等 ）とは汚染された食物^15,16の摂取に起因される。たが、創傷ボツリヌス中毒のいくつかのケース静脈内薬物使用者の間で報告された^17,18。米国では、1歳未満の子供によるクロストリジウム胞子の摂取による乳児ボツリヌス症は、ボツリヌス中毒^19〜21の中で最も一般的な形式です。しかし、不適切な家庭缶詰食品加工に起因する食中毒のBoNTのアウトブレイクは、米国および海外の両方で報告された。 2000-2009の間、食品媒介性ボツリヌス症の少なくとも338例は6死亡例²²を含め世界的に報告された。迅速かつ高感度に食中毒ボツリヌス中毒の発生を検出する能力は、早期診断を支援することができ、重要な指標である^23,24。さらに、費用対効果の高い、日常食品検査できるように検出方法が改善された食料安全保障につながる。

のBoNTの神経細胞の特異性と生物学的半減期が長く、また、それ強力な治療になります。米国において、BoNT系薬剤は、化粧品の条件や眉間のしわ、頸部ジストニア、片頭痛、過活動膀胱、および斜視などの神経筋関連障害の治療のための食品医薬品局（FDA）によって承認されています。多数の「適応外」アプリケーションは、重度の筋機能不全のため^25〜28高用量治療を含む、文書化されています。過剰投与が潜在的に有害な副作用のリスクがある患者を置くながら過少が無効治療につながる可能性がある正確な毒素定量化は、正しい投与のために重要である。残念ながら、標準化された効力アッセイプロトコルはなBoNTに基づく薬剤のprodu間の単位定義不平等で、その結果、製造業者間で共有されていないCTS ^29〜31。

のBoNTのための標準的な試験は、のBoNT含有試料をマウスに腹腔内注射し、死亡者の数は1〜7日以上^16,32,33が記録されたマウスのバイオアッセイである。マウスバイオアッセイは、5月10日PGのBoNT / A ³⁴の検出限界（LOD）と非常に敏感であるが、動物使用上の倫理的な問題、高い人材育成のコストと動物施設、長いアッセイ時間、および欠如を維持標準化されたプロトコルは標準化された、アニマルフリーのBoNTテストおよび定量方法^35-39を開発するために呼び出しされた。最近、いくつかの代替のBoNT定量法は、マウスまたはそれに近いマウスバイオアッセイ感度^40-49を提供すること^が開発された。これらの方法には、一般的に、蛍光、質量分析、または免疫学的方法を使用し、動物を使用することなく、マウスのバイオアッセイよりもかなり短いアッセイ時間を提供します。免疫学的techniqと組み合わせた質量分析のアプローチUEは、食品やその他の複雑なサンプルに含まれているのBoNTを検出し、定量化することが示されたが、人材育成の必要条件と特殊な装置の制限これらのアッセイは^{、50〜55。}他のほとんどの代替のアッセイは、複雑なサンプル試験に容易に適用できないか、日常的なBoNTのテストに必要なスループットを欠いている。のBoNTの極端な効力に一致するように感度のインビトロアッセイ法を開発しようとする食品サンプルの粘度、pH、塩分、およびマトリックス構成成分の高度に可変性は、特に困難な挑戦を提示する。さらに、このようなBoNT系医薬品の再懸濁に起因するものなどであっても、単純で、比較的良性の緩衝系は、有意にインビトロ効力のBoNT ⁵⁶影響を及ぼす塩、アルブミン、および糖安定剤（ すなわち、賦形剤）を含有する。毒素精製は、サンプル^56〜59の最も単純ますが、すべての正確な活性試験のために必要である。

ザ·BoTestマトリックスアッセイは迅速で高スループットのために設計されており、一般的に研究室^56,60で見つかった機器を使用して、高度に複雑なサンプルからのBoNTの一貫した定量化された。これらのアッセイは、共有結合的に結合して、サンプルからのBoNTを封鎖した後、洗浄することによってマトリックス化合物を干渉除去して血清型特異的抗のBoNT抗体に連結常磁性ビーズを使用しています。洗浄後、結合したBoNTタンパク質分解活性は、その後のBoNT血清型は、試験されると互換性のレポーターを用いて最適化反応バッファー中で定量化される。これらのレポーターは、N末端シアン蛍光タンパク質（CFP）部分とを構成するBoNT基板、SNAP25残基141から206またはシナプトブレビン残基33から94で連結されたC末端黄色蛍光タンパク質誘導体（ヴィーナス）部分からなる蛍光性タンパク質であるBoTest A / EまたはB / D / F / Gの記者、それぞれ^45。のBoNTによるレポーター切断は、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて監視される。ときはT彼記者は、CFPの励起はCFP発光と刺激的な金星発光が消光、金星にFRETの結果、無傷である。のBoNTによるレポーターの切断は、CFP発光と金星排出量の減少の増加につながる、FRETを防ぐことができます。活性のBoNT次いで定量的にCFPと金星の発光の比率を用いて測定することができる。 3視聴以下LODは、ハイスループットの96ウェルプレートフォーマット^を使用して、食品⁵⁶の広い範囲から可能である。アッセイは、ビーズ表面上の毒素の濃度を可能にするので、感度の増加は、より大きな試料体積を用いて得ることができる。

のBoNT A、B、E、およびFのためのBoTestマトリックスアッセイは、食品、製薬、環境試料^56,60を使用して開発し、試験した。ここでは、（ 例えば 、食品、環境）のサンプル低複雑でのBoNTの検出のためのこれらのアッセイを実行するための手順（ 例えば医薬品、バッファ内のBoNT）と高い複雑性を説明しています。具体的な処理方法いくつかのサンプルタイプについて、このプロトコルで扱われており、ここでは説明しない試料の種類は、通常、提示される方法の組み合わせを使用して適合させることができる。プロトコルが開発され、テストのBoNT / Aであるが他の場所で^56,60実証されたように、それぞれのアッセイを使用して他のBoNT血清型に適用可能であるした。