细胞因子产生的病毒逃避解剖先天免疫信号
概要
我们描述了一种协议来测量抗病毒细胞因子的产生在感染了模型疱疹病毒，鼠γ-疱疹病毒68（γHV68）小鼠是密切相关的人类卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和Epstein-Barr病毒（EBV）。利用转基因小鼠品系和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs细胞）中，我们评估了抗病毒细胞因子的产生在体内和离体 。 “重构”的淘汰赛中胚胎成纤维细胞通过慢病毒转导的天然免疫成分的表达，我们进一步确定具体的固有免疫分子和剖析关键的信号事件差异调节抗病毒细胞因子的产生。
Abstract
响应于病毒感染，宿主先天免疫反应被激活，上调抗病毒细胞因子的基因表达和生产。相反，病毒已经进化复杂的策略，以规避和利用宿主的免疫信号传导的生存和繁殖。病毒免疫逃避，将会导致宿主防御和病毒逃避，提供了最迷人的和动态的接口之一辨别宿主 – 病毒相互作用。这些研究推进我们理解先天免疫调节和我们铺平道路，以开发新的抗病毒治疗。
鼠γHV68鼠是啮齿动物的天然病原体。 γHV68感染小鼠提供了一个听话的小动物模型，研究抗病毒对人类社会的KSHV和EB病毒的体内病毒-宿主相互作用的扰动并不适用。在这里，我们描述了一个协议来确定抗病毒细胞因子的产生。这个协议可以适于其它vir区使用和信号通路。
最近，我们已发现，γHV68劫持MAVS与IKKβ，胞质RIG-I和MDA5的下游键先天免疫信号分量，废除NFκB活化和抗病毒细胞因子的产生。具体来说，γHV68感染激活IKKβ和激活IKKβ磷酸化的RelA加速的RelA退化。因此，γHV68高效解耦从上游激活IKKβNFκB活化，否定了抗病毒细胞因子基因表达。这项研究阐明了一个复杂的策略，即上游先天免疫激活被病毒病原体截获请求撤销的直接下游转录激活和逃避抗病毒细胞因子的产生。
Introduction
最近的研究已经安装在宿主先天免疫反应中概述的整体信号级联。不同的隔间内居住，模式识别受体（的PRRs）检测病原体相关分子模式不同来源的（的PAMP）来触发先天免疫信号1。视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化抗原5（MDA5）蛋白是细胞内的传感器能够识别RNA分子具有特定的结构特征2。在激活时，RIG-I与其下游MAVS（也称为IPS-1，VISA和CARDIF）适配器，反过来，激活IKK（IKKαβγ）和IKK-相关激酶（TBK1和IKKε，也称为一骑交互）配合物3-6。激活先天免疫激酶磷酸化的基因表达的关键调节剂，包括转录因子和其抑制剂，以及使宿主的抗病毒基因（ 如 IL6，TNF＆＃转录激活945，CCL5和IFNβ）。这些信号级联构成了建立抗微生物状态，在感染的早期阶段，以限制病原体传播烈性固有先天免疫反应。
鼠γHV68是密切相关的人类致癌KSHV和EB病毒。因此，γHV68感染的小鼠提供了一种易于处理的小动物模型，研究对γ疱疹病毒感染的体内7的宿主免疫应答。使用γHV68，我们的实验室已经发现了一个复杂的策略，即γHV68劫持宿主先天免疫信号，使病毒感染。一方面，γHV68激活MAVS-IKKβ途径通过指导激活IKKβ磷酸化的复制式激活（RTA），该病毒的转录因子密钥γHV68复制8，以促进病毒的转录激活。在另一方面，本IKKβ介导的磷酸化素数的RelA降解和术语inatesNFκB激活9。因此，γHV68感染有效地避免了抗病毒细胞因子的产生。有趣的是，利用γHV68的表达文库筛选鉴定RTA作为一个E3连接酶诱导的RelA退化和废除NFκB激活10。这些发现揭示了复杂的免疫逃避策略，即上游免疫信号事件是由γHV68利用，以否定的终极抗病毒细胞因子的产生。
在这里，我们描述了一个协议来衡量抗病毒细胞因子的产生在体内和前VIVØ感染γHV68小鼠。在协议中，我们通过慢病毒转导，从而精确定位特定的固有免疫分子在调节抗病毒细胞因子产生的作用进一步探讨在淘汰赛胚胎成纤维细胞的天然免疫成分的“复原”的表情。这个协议可以很容易地适应其它维鲁SES和信号通路。
Protocol
Representative Results
Discussion
病毒免疫逃避是最有活力和迷人的交互接口病毒进攻和宿主防御9之一。宿主先天免疫成分的结构，使得信号转导被有效地启动和忠实传送。划定信号级联的层次结构和调控是先天免疫的一个主要话题。在这里，我们介绍一个协议，以确定一种天生的免疫成分，MAVS，在细胞因子产生的病毒逃避的调控作用。该协议包括一种方法确定细胞因子产生的病毒感染的小鼠和评估的MEF细胞因子基因表…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
野生型（ 小牛+ / +）和基因敲除（ 小牛– / – ）小鼠，野生型（ 小牛+ / +）和基因敲除（ 小牛– / – ）的MEF由李志坚陈军大学博士（友情提供得克萨斯大学西南医学中心）13。本出版物是基于由美国国立卫生研究院（R01 CA134241和R01 DE021445）和美国癌症协会（RSG-11-162-01-MPC）赠款资助的工作。
Materials
参考文献
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunol. Rev. 243, 91-98 (2011).
- Kawai, T., et al. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
- Xu, L. G., et al. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
- Meylan, E., et al. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
- Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
- Dong, X., et al. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. , (2010).
- Dong, X., Feng, P. Murine gamma herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to abrogate NFkappaB activation and antiviral cytokine production. PLoS Pathog. 7, (2011).
- Dong, X., et al. Murine gammaherpesvirus 68 evades host cytokine production via replication transactivator-induced RelA degradation. J. Virol. 86, 1930-1941 (2012).
- Dong, X., Feng, P. Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus. J. Vis. Exp. , (2011).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
- Sun, Q., et al. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).
