Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène à Gram positif fréquemment utilisé comme un modèle important pour l'étude du parasitisme intracellulaire. Imagerie fin L. monocytogenes stades d'infection dans le contexte de petits écrans ARN interférant permet l'étude globale des voies cellulaires nécessaires à l'infection bactérienne de cellules hôtes cibles.
Pathogènes intracellulaires bactériennes peuvent être conçus comme des outils moléculaires pour disséquer les cascades de signalisation cellulaire en raison de leur capacité à manipuler exquise et subvertir les fonctions cellulaires qui sont nécessaires pour l'infection des tissus cibles de l'hôte. Parmi ces bactéries pathogènes, Listeria monocytogenes est un micro-organisme à Gram positif qui a été utilisé comme un paradigme pour parasitisme intracellulaire dans la caractérisation des réponses immunitaires cellulaires, et qui a joué un rôle instrumental dans la découverte des voies moléculaires contrôlant cytosquelette et la membrane dynamique de la traite. Dans cet article, on décrit un test microscopique robuste pour la détection des stades de l'infection cellulaire L. fin monocytogenes basées sur le marquage fluorescent de RICL, une protéine bactérienne sécrétée qui s'accumule dans le cytoplasme des cellules infectées, ce dosage peut être couplé à de petits écrans d'ARN automatisées à haut débit interférant de manière à carboniseracterize voies de signalisation cellulaires impliqués dans la hausse ou à la régulation à la baisse de l'infection.
La bactérie à Gram positif Listeria monocytogenes est un agent pathogène d'origine alimentaire qui envahit les cellules de l'hôte, perturbe sa vacuole d'internalisation et se réplique dans le cytoplasme des cellules hôtes 1. L. monocytogenes facilité de manipulation dans le contexte de laboratoire (d'une croissance rapide, une faible toxicité pour les individus en bonne santé) associée à la persistance de caractéristiques de virulence bactériennes observées dans des modèles cellulaires et animaux (l'activité hémolytique, leucocytose) a permis son utilisation initiale dans les années 1960 comme un modèle majeur pour l'étude du parasitisme intracellulaire et pour la mise en place des fondements théoriques de l'immunité cellulaire contre l'infection 2. À la fin des années 1980 et au début des années 1990, la dissection du cycle intracellulaire bactérienne 3 ainsi que la caractérisation moléculaire de la virulence bactérienne la plus importante facteurs 4-7 favorisé l'utilisation de L. monocytogenes comme un outil moléculaire clé pour la manipulation et le goujony des fonctions de la cellule hôte. La présence de non virulente (L. innocua) et (L. monocytogenes) espèces virulentes dans le genre Listeria ont ouvert la voie à des études génomiques comparatives 8 qui, avec la création récente de la L. complète monocytogenes transcriptome 9, ont accru notre compréhension de l'évolution de L. monocytogenes comme un agent pathogène humain et en tant que système modèle pour l'infection études de 10.
L. monocytogenes induit son internalisation dans les cellules hôtes lors de l'interaction des protéines de surface bactériennes INLA et INLB avec leurs récepteurs de la cellule hôte E-cadhérine et Met, respectivement 11-12. Études sur la base de candidats initiaux ont conduit à l'identification de l'α / β caténines-actine lien comme une composante importante de la voie InlA-invasion 13 et de la phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) comme un effecteur critique de la InlB- dépendant invasion cascade 14 à 15. Analyses protéomiques et base fonctionnelle suite ont permis d'identifier de nouveaux éléments du cytosquelette et 16 seconds messagers lipidiques 17 requis pour l'invasion de la cellule hôte. Études de la transcription 18 et protéomique de masse basé spectrométrie de 19 quantitatives ont récemment jeté un nouvel éclairage sur l'activation de la signalisation accueil cascades et la répression de la réponse immunitaire au cours de L. monocytogenes infection. Biologie systémique basée sur l'inactivation des grands ensembles de gènes (kinomes, génomes complets) par petits ARN interférents (siRNA) silencieux ont récemment ouvert de nouvelles voies pour l'analyse de l'hôte mondiale cascades de signalisation dans le cadre des fonctions cellulaires spécifiques, y compris la phagocytose et pathogène internalisation 20. Écrans de siRNA du génome entier ont déjà été menées pour examiner cascades cellulaires nécessaires pour l'infection de L. monocytogenes dans phagocytaire Drosophila </em> cellules S2 21-22, mais ce type d'analyse n'a pas été réalisée dans des cellules non-phagocytaires, qui représentent des cibles importantes pour l'infection in vivo.
Nous avons optimisé un protocole pour la détection microscopique des stades tardifs de l'infection par L. monocytogenes qui est adapté pour les études à haut débit siARN d'entrée bactérienne dans les cellules épithéliales. Notre essai tire parti d'un L. hautement invasive monocytogenes souche qui présente une mutation ponctuelle dans PrfA, le régulateur transcriptionnel majeur de L. monocytogenes facteurs de virulence 6: cette mutation (nommé PrfA *) rend PrfA constitutivement active 23 et conduit à une augmentation de l'expression des protéines d'invasion de l'INLA et INLB, favorisant ainsi l'entrée des bactéries dans les cellules non-phagocytaires sinon mal infectés. Notre lecture de l'infection est basé sur la détection de l'accumulation cytosolique de la sécrétée de la protéine bactérienne RICL: cette molécule estun effecteur pleiotrope qui s'exprime préférentiellement par voie intra-cytoplasmique L. 9 monocytogenes et qui participe non seulement à la cellule-cellule au-bactérien réparties 24 mais qui modulent également les réponses immunitaires de l'hôte 25. Le marquage fluorescent des RICL la sécrétion par les bactéries intracellulaires non seulement permet de distinguer clairement infectée à partir de cellules non infectées, mais représente également une lecture du point final qui peut être utilisé par la suite pour disséquer infection dans ses différentes étapes: d'entrée, évasion vacuolaire, bactérienne cytosolique la prolifération et la propagation de cellule à cellule. Ce protocole basé sur la microscopie peut être couplé à écrans siARN donc d'étudier les voies cellulaires impliquées dans l'infection des cellules hôtes par L. monocytogenes.
Plusieurs paramètres sont essentiels pour le succès de notre protocole RICL de détection, y compris l'utilisation de lignées de cellules saines présentant un assez grand cytoplasme pour permettre une détection sans ambiguïté du signal RICL. Dans l'analyse que nous présentons dans cet article, nous proposons l'utilisation de cellules HeLa CCL2, qui sont particulièrement bien adapté à notre analyse en raison de l'extension de leur espace cytosolique; autres clones HeLa comme les cellules HeLa K…
The authors have nothing to disclose.
La recherche en laboratoire P. Cossart est soutenu par l'Institut Pasteur, l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, l'Institut National de la Recherche Agronomique, ERC avancée Grant (233348), l'Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), la Fondation Louis-Jeantet et la Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK est récipiendaire d'une bourse de l'Université Paris-Pasteur Programme Doctoral International / Institut Carnot Maladies Infectieuses. Nous remercions Jason Mercer pour optimiser le protocole de transfection cellulaire.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |